Ácido nucleico antisentido de kanamicina para el tratamiento del cáncer.

Un ácido nucleico aislado para su uso en terapia, en el que dicho ácido nucleico aislado comprende una secuencia antisentido complementaria a un fragmento de la secuencia que codifica para la proteína de resistencia a la kanamicina,

fragmento que es de al menos 50 nucleótidos de longitud y en el que dicho ácido nucleico aislado es capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero.

Ácido nucleico antisentido de kanamicina para el tratamiento del cáncer

5 [0001] La invención como se define en las reivindicaciones 1 a 23 se refiere a un ácido nucleico que

comprende una secuencia complementaria a un fragmento de la secuencia que codifica para la proteína de resistencia a la kanamicina. Este ácido nucleico es útil como adyuvante de vacuna de ADN, y se puede usar, por ejemplo, para el tratamiento del cáncer, por ejemplo, en combinación con un inductor no inmunosupresor de la apoptosis de células tumorales tales como ácido retinoico todo trans (ATRA).

[0002] El cáncer es la segunda causa más frecuente de mortalidad en Estados Unidos, justo después de las enfermedades cardiovasculares. Aproximadamente el 10% de estas muertes por cáncer están provocadas por cánceres de la sangre tales como leucemias, linfomas y mielomas. Solo en la Unión Europea y Estados Unidos, se estima que 1,9 millones de personas padecen cánceres de la sangre. Algunos de estos cánceres de la sangre son

15 enfermedades huérfanas, como la leucemia mieloide aguda (LMA). La leucemia promielocítica aguda (LPA, LMAtipo M3) se caracteriza por una translocación recíproca t( 15; 17) que funde el gen de la leucemia promielocítica (PML) al gen del receptor alfa del ácido retinoico (RÁRa), y por una detención de la diferenciación mieloide en la etapa promielocítica. La terapia de diferenciación mediada por el ácido retinoico todo trans (ATRA) ahora es la base del tratamiento habitual en pacientes con LPA. Sin embargo, a pesar de la supervivencia prolongada obtenida con los 20 ensayos actuales al combinar ATRA con quimioterapia, el 10 % aproximadamente de los pacientes todavía recaen debido a la falta de cumplimiento de la terapia de mantenimiento actual. Por lo tanto, se necesitan nuevas estrategias terapéuticas para erradicar la enfermedad residual y mejorar la calidad de vida.

[0003] Hasta la fecha, se han identificado muchos antígenos asociados a tumores y se han desarrollado 25 estrategias de vacunación que inducen una respuesta inmunitaria contra estos antígenos tumorales. Los antígenos

de proteínas cancerígenas naturales y recombinantes contienen antígenos inmunógenos definidos a niveles normalizados y su eficacia depende de hallar el adyuvante y el sistema de administración adecuados. La administración de ADN, por ejemplo, la inyección directa de cassettes de expresión génicos en hospedadores vivos, es un nuevo enfoque para la vacunación e inmunoterapia. La expresión de los genes administrados puede producir 30 una activación inmunitaria específica de las defensas inmunitarias del hospedador contra el antígeno expresado.

[0004] La eficacia de una estrategia de vacunación depende de la adquisición de una respuesta inmunitaria que pueda ser tanto humoral como citotóxica. Se ha demostrado que las vacunas de ADN cumplen estos requerimientos, lo que da lugar a respuestas inmunitarias mediadas por células (generación de linfocitos T

35 citotóxicos CD8+ y colaboradores CD4+) y humoral potentes y persistentes al antígeno codificado por el plásmido. La aplicación de este tipo de vacunación a cánceres se usó por primera vez en linfoma B no de Hodgkin (B-LNH) usando el idiotipo de la ¡nmunoglobulina de superficie como antígeno contra el cual se obtuvo la respuesta anti- tumoral (Stevenson et al., 1995; Syrengelas et al., 1996, Nature Medicine 2:1038-41, Rice et al., 2008, Nature Reviews 8:108-20). También se observó inmunidad protectora en otros modelos de ratón de linfoma y mieloma.

[0005] Sin embargo, se informó de un deterioro generalizado del sistema inmunitario celular en algunos pacientes con cáncer. Teniendo esto en cuenta, el mal estado inmunitario de estos pacientes, en particular de pacientes con LPA, se considera un obstáculo importante para enfoques inmunoterapéuticos para el tratamiento de estrategias de vacunación solas.

[0006] Padua et al. (2003, Nature Medicine 9:1413-1417) se aprovecharon de un modelo animal de LPA (Brown et al. 1997, Proc Nati Acad Sci USA. 94:2551-6) para someter a ensayo la eficacia in vivo de una vacuna de ÁDN que comprende un ácido nucleico en el que el antígeno tumoral PML-RARa está unido a secuencias del fragmento C de la toxina tetánica (FrC). Sus resultados demuestran que el ATRA actúa como adyuvante con la

50 vacunación de ADN PML-RARa-FrC para prolongar la supervivencia de los ratones LPA. Esto iba acompañado de un incremento en los linfocitos T CD4+ and CD8+, los anticuerpos del RARa y la producción de IFNy, lo que demuestra la inducción de respuestas inmunitarias relevantes.

[0007] El documento WO 03/090778 además enseña que composiciones de vacuna que comprenden (i) un 55 inductor no inmunosupresor de la apoptosis de células tumorales tal como ATRA y (¡i) un ácido nucleico que

comprende una secuencia que codifica un polipéptido inmunógeno tal como PML-RARaFrC, PML-RARaAS-FrC o ScFvBCL1-FrC rescataron a ratones LPA de recaída y muerte.

[0008] Por lo tanto, las terapias de combinación de una vacuna de ADN con la administración de ATRA

constituyen tratamientos prometedores para leucemias (Padua y Chomienne 2004, Discovery Medicine 4:41-44). Existe una necesidad en la técnica del desarrollo de adyuvantes de ADN que sean útiles para aumentar la respuesta inmunitaria en pacientes con cáncer.

5 DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0009] La presente invención se define en las reivindicaciones 1 a 23.

[0010] Sorprendentemente se ha comprobado que la secuencia KanAS de la SEQ ID NO: 1, que es 10 complementaria a un fragmento de la secuencia que codifica para la proteína de resistencia a la kanamicina, es un

adyuvante muy eficiente en la vacunación con ADN.

[0011] Más específicamente, los inventores han demostrado que un plásmido que comprende la secuencia KanAS de la SEQ ID NO: 1, solo o fusionado con el antígeno tumoral PML-RARa prolongaba la supervivencia de

15 ratones LPA cuando se administraba en combinación con ATRA. Además, la KanAS sola prolongaba la vida de ratones SMD. Las respuestas inmunitarias se midieron mediante citometría de flujo, y se comprobó que ratones SMD tratados con KanAS sola presentaban tres veces más linfocitos T de memoria en comparación con ratones FVB/N de tipo silvestre identificados. Por otra parte, la población progenitora de células pluripotenciales leucémicas se redujo tras el tratamiento con KanAS (25% aproximadamente en ratones sin tratar frente al 10% 20 aproximadamente en ratones tratados). Por último, se observó una regulación al alza transitoria del transcrito MyD88, que se encuentra en la vía aguas abajo de los receptores de tipo Toll (TLRs), receptores para los que el ADN es uno de los ligandos.

[0012] Se puede clonar aguas arriba o aguas abajo de la KanAS cualquier antígeno que ejerza una respuesta 25 inmunitaria. La vacunación de ADN con un ácido nucleico que comprende KanAS por tanto es aplicable a todos los

cánceres, y a muchas otras enfermedades que requieran respuestas inmunitarias, incluyendo enfermedades infecciosas. La estrategia de vacunación con ADN desvelada en la presente solicitud también puede ser aplicable a individuos con una predisposición hereditaria al cáncer tal como cáncer de mama y de colon, en el que los oncogenes se encuentran en la línea germinal y heredados.

[0013] Además, y a diferencia de las vacunas autólogas, las vacunas de ADN desveladas en la presente solicitud no son vacunas específicas para una enfermedad cancerígena determinada. Tampoco presentan ningún riesgo de Inducir autolnmunldad a un antígeno. Además, estas vacunas se pueden fabricar mediante procesos de fermentación bacteriana convencionales que se pueden escalar fácilmente.

Ácidos nucleicos de KanAS desvelados en la presente invención

[0014] La presente solicitud desvela un ácido nucleico aislado y/o purificado que comprende, o está constituido por, una secuencia complementaria a un fragmento de la secuencia que codifica para la proteína de

40 resistencia a la kanamicina. Dicho ácido nucleico se denomina como "ácido nucleico de KanAS". Dicho fragmento de la secuencia que codifica para la proteína de resistencia a la kanamicina puede ser de cualquier longitud, por ejemplo de al menos, como máximo o aproximadamente 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 473 o 500 nucleótidos consecutivos.

45 [0015] En el contexto de la presente invención, un "ácido nucleico" se refiere a la forma polimérica del éster

de fosfato de ribonucleósidos ("moléculas de ARN") o desoxirribonucleósidos ("moléculas de ADN"), o cualquiera de sus análogos de fosfoéster, tales como fosforotioatos y tioésteres, en forma de cadena sencilla,... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico aislado para su uso en terapia, en el que dicho ácido nucleico aislado comprende una secuencia antisentido complementaria a un fragmento de la secuencia que codifica para la proteína de

5 resistencia a la kanamicina, fragmento que es de al menos 50 nucleótidos de longitud y en el que dicho ácido nucleico aislado es capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero.

2. Un ácido nucleico aislado para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia antisentido está constituida por una secuencia seleccionada del grupo constituido por:

(a) una secuencia complementaria a un fragmento de la SEQ ID NO: 9, en el que dicho fragmento comprende al menos 50 nucleótidos consecutivos de los nucleótidos situados entre la posición 1226 y la posición 2020 de la SEQ ID NO: 9;

(b) la secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2;

15 (c) una secuencia al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y

(d) un fragmento de al menos 50 nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

3. El ácido nucleico para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicho ácido nucleico además comprende una secuencia que codifica un polipéptido inmunógeno.

4. El ácido nucleico para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho polipéptido inmunógeno es un antígeno tumoral.

5. El ácido nucleico para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha secuencia que 25 codifica un antígeno tumoral es al menos un 80 % idéntica a la secuencia de PML-RARa de la SEQ ID NO: 5.

6. El ácido nucleico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por:

30 a) la secuencia SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4;

b) una secuencia al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y

c) un fragmento de al menos 50 nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

7. El ácido nucleico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el 35 tratamiento y/o prevención del cáncer, tumores benignos o enfermedades infecciosas.

8. El ácido nucleico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso simultáneo o secuencial en combinación con un inductor no inmunosupresor de la apoptosls de células tumorales en el tratamiento y/o la prevención del cáncer.

9. El ácido nucleico para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que dicho cáncer es un cáncer de colon, un cáncer de mama o un cáncer de la sangre seleccionado del grupo constituido por leucemia linfoide, leucemia mieloide, leucemia promielocítica aguda (LPA), síndrome mielodisplásico (SMD), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mielomonocítica (LMMC), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mieloide

45 crónica (LMC), leucemia linfoblástica aguda (LLA), linfoma de Hodgkin (LH), linfoma no Hodgkin (LNH) y mieloma múltiple (MM).

10. El ácido nucleico para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que dicho cáncer es un tumor sólido seleccionado del grupo constituido por un carcinoma, un adenocarcinoma, un sarcoma, un melanoma,

50 un mesotelioma y un blastoma.

11. Una composición farmacéutica que comprende:

(i) un ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un vector que comprende 55 dicho ácido nucleico;

(¡i) un vehículo fisiológicamente aceptable; y, opcionalmente,

(i¡¡) un inductor no inmunosupresor de la apoptosis de células tumorales.

12. Una combinación de:

(i) una primera composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un vector que comprende dicho ácido nucleico en un vehículo fisiológicamente aceptable; y

(ii) una segunda composición farmacéutica que comprende un inductor no inmunosupresor de la apoptosis de 5 células tumorales en un vehículo fisiológicamente aceptable.

13. Un vector para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 7 a 10, dicho vector

que comprende el ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

10 14. Una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a

10, que comprende:

(i) un ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un vector que comprende dicho ácido nucleico;

15 (ii) un vehículo fisiológicamente aceptable; y, opcionalmente,

(iii) un inductor no inmunosupresor de la apoptosis de células tumorales.

15. Una combinación para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, dicha

combinación que comprende:

(i) una primera composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un vector que comprende dicho ácido nucleico en un vehículo fisiológicamente aceptable; y

(ii) una segunda composición farmacéutica que comprende un inductor no inmunosupresor de la apoptosis de células tumorales en un vehículo fisiológicamente aceptable.

16. El ácido nucleico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, o la combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho inductor no inmunosupresor de la apoptosis de células tumorales es un compuesto retinoide o un compuesto relacionado con arsénico.

17. El ácido nucleico, la composición farmacéutica, o la combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicho compuesto retinoide es ATRA.

18. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia antisentido complementaria a un fragmento 35 de la secuencia que codifica para la proteína de resistencia a la kanamicina, cuyo fragmento es de al menos 100 y

como máximo de 450 nucleótidos de longitud, en el que la secuencia antisentido codifica al menos un polipéptido ¡nmunógeno seleccionado del grupo constituido por un polipéptido de secuencia SEQ ID NO: 18 y un polipéptido de secuencia SEQ ID NO: 19.

40 19. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia antisentido complementaria a un fragmento

de la secuencia que codifica para la proteína de resistencia a la kanamicina, cuyo fragmento es de al menos 100 nucleótidos de longitud, en el que dicha secuencia antisentido codifica al menos un polipéptido inmunógeno seleccionado del grupo constituido por un polipéptido de secuencia SEQ ID NO: 18 y un polipéptido de secuencia SEQ ID NO: 19 y constituido por una secuencia seleccionada del grupo constituido por:

(a) una secuencia complementaria a un fragmento de la SEQ ID NO: 9, en el que dicho fragmento comprende al menos 100 nucleótidos consecutivos de los nucleótidos situados entre la posición 1226 y la posición 2020 de la SEQ ID NO: 9;

(b) la secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2;

50 (c) una secuencia al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o al menos un 85 % idéntica a la SEQ ID NO: 2; y (d) un fragmento de al menos 100 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

20. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18 o 19, en el que dicho ácido nucleico además comprende una secuencia que codifica un polipéptido inmunógeno, dicho polipéptido inmunógeno que es un

55 antígeno tumoral.

21. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicha secuencia que codifica un antígeno tumoral es al menos un 80 % idéntica a la secuencia de PML-RARa de la SEQ ID NO: 5.

22. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 20 o 21, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por:

(a) la secuencia SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4;

5 (b) una secuencia al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y

(c) un fragmento de al menos 100 nucleótldos consecutivos de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

23. Un vector que comprende el ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22.