Vectores de clonación.

Un vector de clonación pUSEC-05IQ que tiene el Número de Registro ATCC PTA-5567.

Vectores de clonación

Campo de la invención La presente invención se refiere a la expresión directa de un producto peptídico en el medio de cultivo de células hospedadoras modificadas genéticamente que expresan el producto peptídico. Más particularmente, la invención se refiere a vectores de clonación, vectores de expresión, células hospedadoras y/o métodos de fermentación para producir un producto peptídico que se excreta al exterior del hospedador en el medio de cultivo con un alto rendimiento. En algunas realizaciones, la invención se refiere a la expresión directa de un producto peptídico que tiene glicina en el extremo C, que posteriormente se convierte en un péptido amidado que tiene un grupo amino en lugar de dicha glicina.

Descripción de la técnica relacionada Existen varias técnicas para la producción recombinante de productos peptídicos, es decir cualquier compuesto cuya estructura molecular incluya una pluralidad de aminoácidos unidos por un enlace peptídico. Un problema cuando el producto peptídico extraño es pequeño es que a menudo es fácilmente degradable por las proteasas endógenas en el citoplasma o periplasma de la célula hospedadora que se utilizó para expresar el péptido. Otros problemas incluyen la consecución de una producción suficiente, y la recuperación del péptido en una forma relativamente pura sin alterar su estructura terciaria (lo que puede disminuir indeseablemente su capacidad para llevar a cabo su función básica) . Para superar el problema del tamaño pequeño, la técnica anterior expresaba el producto peptídico de interés como una proteína de fusión con otro péptido (habitualmente más grande) y se acumulaba esta proteína de fusión en el citoplasma. El otro péptido puede cumplir varias funciones, por ejemplo, para proteger el péptido de interés de la exposición a las proteasas presentes en el citoplasma del hospedador. Un sistema de expresión tal se describe en Ray et al., Biol Technology, Vol. 11, páginas 64-70, (1993) .

Sin embargo, el aislamiento del producto peptídico utilizando tal tecnología requiere la escisión de la proteína de fusión y su purificación de entre todos los péptidos que se encuentran normalmente en el citoplasma del hospedador. Esto puede necesitar otras varias etapas que pueden disminuir la eficacia general del proceso. Por ejemplo, cuando una proteína de la técnica anterior se acumula en el citoplasma, las células habitualmente tienen que recogerse y destruirse, y los residuos celulares se tienen que eliminar en una etapa de clarificación. Todo esto se evita de acuerdo con la presente invención en la que el producto peptídico de interés se expresa directamente en,

y se recupera de, el medio del cultivo.

En la técnica anterior a menudo es necesario el uso de una etapa de cromatografía de afinidad para purificar la proteína de fusión, la cual aún debe someterse a la escisión para separar el péptido de interés de su compañero de fusión. Por ejemplo, en el artículo Biol Technology identificado anteriormente, el precursor de la calcitonina de salmón se escindía de su compañero de fusión utilizando bromuro de cianógeno. Esa etapa de escisión necesita aún otras etapas adicionales para proteger los grupos sulfhidrilos de cisteína en las posiciones 1 y 7 del precursor de la calcitonina de salmón. Se ha utilizado la sulfonación para proporcionar grupos de protección a las cisteínas. Esto a su vez alteraba la estructura terciaria del precursor de la calcitonina de salmón lo que necesitaba una renaturalización posterior del precursor (y por supuesto la eliminación de los grupos de protección) .

El producto peptídico en la presente invención se expresa solo con una señal de secuencia y no se expresa con un gran compañero de fusión. La presente invención da como resultado una “expresión directa”. Se expresa inicialmente con una región de señal unida en el lado de su extremo N. Sin embargo, esta región de señal se escinde de manera post-traduccional durante la secreción del producto peptídico en el periplasma de la célula. Posteriormente, el producto peptídico se difunde o bien se excreta desde el periplasma al medio de cultivo en el exterior de la célula, donde puede recuperarse en su forma terciaria apropiada. No se une a ningún compañero de fusión cuya eliminación puede requerir primero la destrucción celular por desnaturalización o modificación, aunque en algunas realizaciones de la invención, se utiliza la sulfonación para proteger los grupos sulfhidrilos de la cisteína durante la purificación del producto peptídico.

Otro problema con la acumulación del producto peptídico en el interior de la célula de la técnica anterior, es que el producto que se acumula puede ser tóxico para la célula y puede por tanto limitar la cantidad de proteína de fusión que se puede sintetizar. Otro problema con esta estrategia es que el compañero de fusión más grande habitualmente constituye la mayoría del rendimiento. Por ejemplo, el 90 % del rendimiento de la producción puede ser el compañero de fusión mayor, dando como resultado de este modo que solo el 10 % del rendimiento corresponda al péptido de interés. Otro problema más con esta estrategia es que la proteína de fusión puede formar cuerpos de inclusión insolubles en la célula, y la solubilización de los cuerpos de inclusión seguida por la escisión puede que no produzca péptidos biológicamente activos.

La técnica anterior intentaba expresar el péptido junto con un péptido señal anclado al extremo N para dirigir el producto peptídico deseado para que se secrete al periplasma (véase, EP 177.343, Genentech Inc.) . Se han

identificado varios péptidos señal (véase Watson, M. Nucleic Acids Research, Vol. 12, Nº 13, pp: 5145-5164) . Por ejemplo, Hsiung et al. (Biotechnology, Vol 4, Noviembre 1986, pp: 991-995) utilizaron el péptido señal de la proteína A de membrana externa (OmpA) de E. coli para dirigir ciertos péptidos al periplasma. La mayoría de las veces, los péptidos segregados al periplasma tienden frecuentemente a permanecer ahí con una excreción mínima al medio.

Se puede necesitar una etapa más no deseable para alterar o permeabilizar la membrana externa para liberar suficientes cantidades de los componentes periplasmáticos. Algunos intentos de la técnica anterior para excretar los péptidos del periplasma al medio de cultivo en el exterior de la célula incluyeron poner en peligro la integridad de la barrera de la membrana externa haciendo que el hospedador expresara simultáneamente el producto peptídico deseado que contenía un péptido señal junto con una proteína lítica de péptidos que producía que la membrana externa se convirtiera en permeable o que tuviera fugas (Patente de Estados Unidos Nº 4.595.658) . Sin embargo, es necesario tener cuidado con la cantidad de proteína lítica de péptidos producida para no poner en peligro la integridad celular y destruir las células. La purificación del péptido de interés también se puede hacer más difícil con esta técnica.

El documento WO 98/46722 desvela sistemas de expresión para la expresión directa de productos peptídicos en medios de cultivo.

Ray et al., (2002) Protein Expression and Purification, vol. 26, nº 2, páginas 249-259, desvela la producción de calcitonina de salmón por expresión directa de un precursor extendido con glicina en Escherichia coli.

Baneyx et al., (1991) Journal of Bacteriology vol 173, nº 8, páginas 2696-2703, desvela la construcción y caracterización de cepas de Escherichia coli deficientes en múltiples proteasas secretadas: la proteasa III degrada sustratos de alto peso molecular in vivo.

Lin Ying y Lu Shengdong (1996) Chinese Medical Sciences Journal, vol. 11, nº 4, páginas 204-208, desvelan el uso de una repetición en tándem del cartucho de expresión como una estrategia nueva para potenciar la eficacia de expresión del gen clonado en Escherichia coli.

Ghrayeb et al., (1984) , The EMBO Journal, vol. 3, nº 10, páginas 2437-2442, desvela vectores de clonación de secreción de Escherichia coli.

Aparte de las técnicas de desestabilización de la membrana externa descritas anteriormente, hay medios menos estrictos para permeabilizar la membrana externa de bacterias gram negativas. Estos métodos no producen necesariamente la destrucción de la membrana externa lo que puede conducir a una viabilidad celular menor. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, el uso de agentes catiónicos (Martti Vaara, Microbiological Reviews, Vol. 56, páginas 395-411 (1992) ) y glicina (Kaderbhai et al., Biotech. Appl. Biochem, Vol. 25, páginas 53-61 (1997) ) . Los agentes catiónicos permeabilizan la membrana... [Seguir leyendo]

1. Un vector de clonación pUSEC-05IQ que tiene el Número de Registro ATCC PTA-5567.

2. Un vector de clonación pUSEC-06 que tiene el Número de Registro ATCC PTA-5568.