Células hospedadoras bacterianas mejoradas para la expresión directa de péptidos.

Una célula hospedadora E. coli modificada genéticamente deficiente en los genes cromosómicos recA y ptr quecodifican la proteína A de recombinación y Proteasa III, respectivamente.

Células hospedadoras bacterianas mejoradas para la expresión directa de péptidos

Campo de la invención La presente invención se refiere a la expresión directa de un producto peptídico en el medio de cultivo de células hospedadoras modificadas genéticamente que expresan el producto peptídico. Más particularmente, la divulgación se refiere a vectores de clonación, vectores de expresión, células hospedadoras y/o métodos de fermentación para producir un producto peptídico que se excreta al exterior del hospedador en el medio de cultivo con un alto rendimiento. En algunas realizaciones, la invención se refiere a la expresión directa de un producto peptídico que tiene glicina en el extremo C, que posteriormente se convierte en un péptido amidado que tiene un grupo amino en lugar de dicha glicina.

Descripción de la técnica relacionada Existen varias técnicas para la producción recombinante de productos peptídicos, es decir cualquier compuesto cuya estructura molecular incluya una pluralidad de aminoácidos unidos por un enlace peptídico. Un problema cuando el producto peptídico extraño es pequeño es que a menudo es fácilmente degradable por las proteasas endógenas en el citoplasma o periplasma de la célula hospedadora que se utilizó para expresar el péptido. Otros problemas incluyen la consecución de una producción suficiente, y la recuperación del péptido en una forma relativamente pura sin alterar su estructura terciaria (lo que puede disminuir indeseablemente su capacidad para llevar a cabo su función básica) . Para superar el problema del tamaño pequeño, la técnica anterior expresaba el producto peptídico de interés como una proteína de fusión con otro péptido (habitualmente más grande) y se acumulaba esta proteína de fusión en el citoplasma. El otro péptido puede cumplir varias funciones, por ejemplo, para proteger el péptido de interés de la exposición a las proteasas presentes en el citoplasma del hospedador. Un sistema de expresión tal se describe en Ray et al., Biol Technology, Vol. 11, páginas 64-70, (1993) .

Sin embargo, el aislamiento del producto peptídico utilizando una tecnología de este tipo requiere la escisión de la proteína de fusión y su purificación de entre todos los péptidos que se encuentran normalmente en el citoplasma del hospedador. Esto puede necesitar otras varias etapas que pueden disminuir la eficacia general del proceso. Por ejemplo, cuando una proteína de la técnica anterior se acumula en el citoplasma, las células habitualmente tienen que recogerse y destruirse, y los residuos celulares se tienen que eliminar en una etapa de clarificación. Todo esto se evita de acuerdo con la presente invención en la que el producto peptídico de interés se expresa directamente en,

y se recupera de, el medio del cultivo.

En la técnica anterior a menudo es necesario el uso de una etapa de cromatografía de afinidad para purificar la proteína de fusión, la cual aún debe someterse a la escisión para separar el péptido de interés de su compañero de fusión. Por ejemplo, en el artículo Biol Technology identificado anteriormente, el precursor de la calcitonina de salmón se escindía de su compañero de fusión utilizando bromuro de cianógeno. Esa etapa de escisión necesita aún otras etapas adicionales para proteger los grupos sulfhidrilos de cisteína en las posiciones 1 y 7 del precursor de la calcitonina de salmón. Se ha utilizado la sulfonación para proporcionar grupos de protección a las cisteínas. Esto a su vez alteraba la estructura terciaria del precursor de la calcitonina de salmón lo que necesitaba una renaturalización posterior del precursor (y por supuesto la eliminación de los grupos de protección) .

El producto peptídico se expresa solo con una señal de secuencia y no se expresa con un gran compañero de fusión. La presente invención da como resultado una “expresión directa”. Se expresa inicialmente con una región de señal unida en el lado de su extremo N. Sin embargo, esta región de señal se escinde de manera post-traduccional durante la secreción del producto peptídico en el periplasma de la célula. Posteriormente, el producto peptídico se difunde o bien se excreta desde el periplasma al medio de cultivo en el exterior de la célula, donde puede recuperarse en su forma terciaria apropiada. No se une a ningún compañero de fusión cuya eliminación puede requerir primero la destrucción celular por desnaturalización o modificación, aunque en algunas realizaciones de la divulgación, se utiliza la sulfonación para proteger los grupos sulfhidrilos de la cisteína durante la purificación del producto peptídico.

Otro problema con la acumulación del producto peptídico en el interior de la célula de la técnica anterior, es que el producto que se acumula puede ser tóxico para la célula y puede por tanto limitar la cantidad de proteína de fusión que se puede sintetizar. Otro problema con esta estrategia es que el compañero de fusión más grande habitualmente constituye la mayoría del rendimiento. Por ejemplo, el 90 % del rendimiento de la producción puede ser el compañero de fusión mayor, dando como resultado de este modo que solo el 10 % del rendimiento corresponda al péptido de interés. Otro problema más con esta estrategia es que la proteína de fusión puede formar cuerpos de inclusión insolubles en la célula, y la solubilización de los cuerpos de inclusión seguida por la escisión puede que no produzca péptidos biológicamente activos.

La técnica anterior intentaba expresar el péptido junto con un péptido señal anclado al extremo N para dirigir el producto peptídico deseado para que se secrete al periplasma (véase, EP 177.343, Genentech Inc.) . Se han identificado varios péptidos señal (véase Watson, M. Nucleic Acids Research, Vol. 12, Nº 13, pp: 5145- 5164) . Por ejemplo, Hsiung et al. (Biotechnology, Vol 4, Noviembre 1986, pp: 991- 995) utilizaron el péptido señal de la proteína A de membrana externa (OmpA) de E. coli para dirigir ciertos péptidos al periplasma. La mayoría de las veces, los péptidos segregados al periplasma tienden frecuentemente a permanecer ahí con una excreción mínima al medio. 5 Se puede necesitar una etapa más no deseable para alterar o permeabilizar la membrana externa para liberar suficientes cantidades de los componentes periplasmáticos. Algunos intentos de la técnica anterior para excretar los péptidos del periplasma al medio de cultivo en el exterior de la célula incluyeron poner en peligro la integridad de la barrera de la membrana externa haciendo que el hospedador expresara simultáneamente el producto peptídico deseado que contenía un péptido señal junto con una proteína lítica de péptidos que producía que la membrana externa se convirtiera en permeable o que tuviera fugas (Patente de Estados Unidos Nº 4.595.658) . Sin embargo, es necesario tener cuidado con la cantidad de proteína lítica de péptidos producida para no poner en peligro la integridad celular y destruir las células. La purificación del péptido de interés también se puede hacer más difícil con esta técnica.

Aparte de las técnicas de desestabilización de la membrana externa descritas anteriormente, hay medios menos estrictos para permeabilizar la membrana externa de bacterias gram negativas. Estos métodos no producen necesariamente la destrucción de la membrana externa lo que puede conducir a una viabilidad celular menor. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, el uso de agentes catiónicos (Martti Vaara, Microbiological Reviews, Vol. 56, páginas 395-411 (1992) ) y glicina (Kaderbhai et al., Biotech. Appl. Biochem, Vol. 25, páginas 53-61 (1997) ) . Los agentes catiónicos permeabilizan la membrana externa interaccionando con y causando un daño a la estructura de lipopolisacáridos de la membrana externa. La cantidad de daño y alteración puede ser no letal o letal dependiendo de la concentración utilizada. La glicina puede remplazar los restos de alanina en el péptido componente de los peptidoglicanos. El peptidoglicano es uno de los componentes estructurales de la pared celular externa de las bacterias gram negativas. Cultivando E. coli en altas concentraciones de glicina se aumenta la frecuencia de remplazos de alanina por glicina dando como resultado una pared celular con defectos, y por tanto con un aumento de la permeabilidad.

Otro método de la técnica anterior para causar la excreción de un producto peptídico deseado conlleva la fusión del producto a una proteína transportadora que se excreta normalmente al medio (hemolisina) o una proteína entera expresada en la membrana externa (por ejemplo, la proteína ompF) . Por ejemplo, la endorfina β humana puede excretarse como una proteína de fusión por... [Seguir leyendo]

1. Una célula hospedadora E. coli modificada genéticamente deficiente en los genes cromosómicos recA y ptr que codifican la proteína A de recombinación y Proteasa III, respectivamente. 5

2. Una cepa BLM6 mutante de BRL que tiene el Número de Registro ATCC PTA-5500.

3. Una célula hospedadora E. coli modificada genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1, conteniendo y

expresando dicha célula hospedadora E. coli un vector de expresión que comprende una pluralidad de casetes de 10 transcripción en tándem, comprendiendo cada casete:

(1) una región codificante con ácidos nucleicos que codifican un producto peptídico acoplada en marco de lectura 3’ de ácidos nucleicos que codifican un péptido señal; y

(2) una región de control unida operativamente a la región codificante, comprendiendo dicha región de control 15 una pluralidad de promotores.

4. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3 que es UGL801 y tiene el Número de Registro ATCC PTA-5501.

5. Un método de producción de un producto peptídico que comprende cultivar la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3 en un medio de cultivo y luego recuperar el producto peptídico del medio en el que se ha cultivado la célula hospedadora.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que no se introduce en el medio una fuente de carbono externa hasta que la fuente de carbono presente inicialmente se ha agotado hasta un nivel al que no podría continuar manteniendo la vida de dicho hospedador en ausencia de introducción de una fuente de carbono externa en el medio, y en el que la fuente de carbono se añade a partir de entonces a una tasa que mantenga dicha tasa de crecimiento entre 0, 05 y 0, 20 duplicaciones por hora.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que un método de inducción comienza antes de la fase estacionaria.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el método de inducción es por adición de un inductor

químico. 35

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la inducción es por adición de al menos un inductor seleccionado de entre el grupo que consiste en IPTG y lactosa.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que se añaden un inductor, una fuente de carbono y

vitaminas durante cada hora de las fases de inducción y estacionaria en cantidades tales que la relación de peso entre el inductor y la fuente de carbono añadidos en una hora cualquiera no varía en más del 50 % de la relación añadida durante el periodo completo de fermentación.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la célula hospedadora se cultiva durante un periodo de 45 entre 20 y 32 horas post inducción.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la célula hospedadora se cultiva durante un periodo de entre 22 y 27 horas post inducción.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la célula hospedadora se cultiva a una temperatura entre 28 y 34 ºC.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la célula hospedadora se cultiva a una temperatura entre 31, 5 y 32, 5 ºC. 55

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la fuente de carbono es glicerol.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la recuperación de dicho producto peptídico comprende:

(a) separar las células hospedadoras del medio de cultivo; y

(b) someter el medio a cromatografía líquida en fase inversa y recuperar fracciones que contienen el producto peptídico; y

(c) someter dichas fracciones de la etapa (b) a cromatografía de intercambio catiónico, y

(d) a continuación recuperar fracciones que contienen el producto peptídico. 65

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la recuperación de dicho producto peptídico comprende:

(a) separar las células hospedadoras del medio de cultivo; y

(b) someter el medio a cromatografía de intercambio catiónico y recuperar fracciones que contienen dicho 5 producto peptídico; y

(c) someter la fracción recuperada de la etapa (b) a cromatografía líquida en fase inversa y recuperar fracciones que contienen producto peptídico;

(d) someter las fracciones recuperadas en la etapa (c) a cromatografía de intercambio catiónico, y

(e) a continuación recuperar fracciones que contienen el producto peptídico. 10

18. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además alterar el pH del medio de cultivo, inmediatamente después de terminar la fermentación, a un nivel en el que se reduzca la degradación proteolítica del producto.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además la bajada de temperatura del medio de cultivo por debajo de 10 ºC después de que termine la fermentación.

20. Un método de producción de un producto peptídico amidado que comprende las etapas de:

(a) cultivar la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3 en un medio de cultivo en el que el producto peptídico incluye una glicina en el extremo C.

(b) recuperar dicho producto peptídico de dicho medio de cultivo; y

(c) convertir dicho producto peptídico en un péptido amidado convirtiendo dicha glicina del extremo C en un

grupo amino. 25

21. Un método de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicha conversión a un péptido amidado se consigue por:

(a) formación de una mezcla de reacción poniendo en contacto dicho producto peptídico con oxígeno y un agente reductor en presencia de peptidil glicina monooxigenasa α-amidante, o peptidil glicina monooxigenasa αhidroxilante;

(b) si la peptidil glicina monooxigenasa α-amidante no se utiliza en la etapa (a) , y si la mezcla de reacción no es aún básica, entonces aumento del pH de la mezcla de reacción hasta que sea básico; y

(c) recuperación de dicho péptido amidado de dicha mezcla de reacción. 35

22. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la recuperación del péptido amidado comprende al menos una de las etapas seleccionadas de entre el grupo que consiste en cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía en fase inversa.

23. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 1 que sea UGL810 que tiene el Número de Registro ATCC PTA-5502.

24. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 1 que sea UGL820 que tiene el Número de Registro ATCC PTA-5569.