Uso de sulfato de condroitina para reducir la unión no específica en inmunoensayos de troponina I.

Un reactivo de inmunoensayo que comprende:

un agente de unión al analito en un diluyente;

y sulfato de condroitina en una cantidad suficiente para reducir la unión no específica en un ensayo de una muestra para el analito,

en el que el analito es troponina I, en el que el agente de unión al analito es un anticuerpo para el analito o un receptor para el analito.

Uso de sulfato de condroitina para reducir la unión no específica en inmunoensayos de troponina I CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere al campo de los inmunoensayos, y más particularmente al campo de los glucosaminoglicanos para reducir la unión no específica en inmunoensayos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se usan ampliamente ensayos de unión bioquímicos para determinar la presencia y la concentración de analitos en especímenes biológicos. Tales ensayos se basan en el concepto de componentes de unión. Un analito de interés se une a un agente de unión al analito (tal como, por ejemplo, un anticuerpo para el analito, o un receptor para el analito), y el analito y el agente de unión al analito se denominan por consiguiente componentes de unión. Si uno de los componentes de unión está unido a una fase sólida, el ensayo se denomina un ensayo heterogéneo. Tales ensayos heterogéneos incluyen, por ejemplo, el procedimiento de sándwich, el procedimiento indirecto y el procedimiento competitivo, todos los términos fácilmente reconocidos en la materia.

La sensibilidad de un ensayo normalmente se refiere a la masa más pequeña del analito que genera un cambio estadísticamente significativo en la señal generada por el ensayo cuando se compara con la lectura de la señal obtenida en ausencia del analito. Se desea elevada sensibilidad debido a que permite la detección de cantidades más pequeñas de analito, además de una medición de mayor precisión total de un analito.

Unión no específica se refiere a interacciones no específicas de los componentes de unión en un sistema de ensayo heterogéneo con una fase sólida. La unión no específica frecuentemente reduce la sensibilidad de los ensayos heterogéneos y, por tanto, es deseable reducir tal unión no específica.

Se conocen varios procedimientos para este fin. Por ejemplo, se han añadido proteínas, tales como albúmina de suero bovino (BSA), gelatina y caseína, a reactivos de ensayo o preadsorbido sobre la fase sólida con el fin de bloquear sitios de adsorción no específicos. Adicionalmente, se ha informado del uso de diversos tensioactivos, frecuentemente a alta concentración, en la bibliografía.

El documento WO 2004/092733 describe el uso de un polímero cargado para mejorar la separación de complejos usando un canal de separación en un dispositivo microfluídico. El documento WO 2004/092733 también desvela que el polímero cargado puede bloquear la interferencia con el ensayo de desplazamiento de la migración interaccionando con los constituyentes de muestra que interfieren con el ensayo. El documento JP H02 238361 desvela un reactivo de inmunoensayo que comprende sulfato de condroitina para su uso con antígenos o anticuerpos de analito. El documento JP H02 238361 también desvela que el sulfato de condroitina no disminuye reacciones específicas. Roberts y col. (Clin. Chem. 43, 5, pág. 860-861, 1997) desvela un inmunoensayo para troponina I.

Aunque estas técnicas pueden ayudar a reducir alguna adsorción no específica, muchas de las técnicas se han asociado a interferencia con la interacción específica deseada de los componentes de unión. Estas técnicas pueden también conducir al desplazamiento del complejo que se forma entre los componentes de unión. Adicionalmente, a pesar del uso de altas concentraciones de proteína y tensioactivo, normalmente todavía existe una cantidad considerable de unión no específica en muchos ensayos heterogéneos. Por consiguiente, se necesitan medios alternativos para reducir la unión no específica en ensayos heterogéneos.

Esto es especialmente cierto en el caso de ensayos para troponina I cardíaca en los que los niveles de analito que se detectan son muy pequeños y es necesaria elevada sensibilidad para resultados de ensayo precisos y útiles. La medición de troponina I cardíaca ayuda en el diagnóstico preciso de infarto agudo de miocardio y en la estratificación del riesgo de pacientes con síndromes coronarios agudos sin elevación del segmento ST con respecto a riesgo relativo de mortalidad, infarto de miocardio, o elevada probabilidad de acontecimientos isquémicos que requieren procedimientos de revascularización urgentes.

La troponina I (Tnl) es una proteína normalmente encontrada en tejido de músculo que, conjuntamente con la troponina T y la troponina C, regula la interacción dependiente de calcio de actina y miosina (Tobacman, Annu Rev Physiol 58:447-481, 1996). Se han identificado tres isotipos de Tnl: uno asociado a músculo esquelético de sacudida rápida, uno con músculo esquelético de sacudida lenta, y uno con músculo cardíaco (Wilkinson y Grand, Nature 271:31-35, 1978; Bodor, J Clin Immunoassay 17(1):40-44, 1994). La forma cardíaca tiene 31 residuos de aminoácidos adicionales en el extremo N y es la única isoforma de troponina presente en el miocardio (Vallins y col., FEBS Letts 270(1,2):57-61, 1990)

Estudios clínicos han demostrado que la troponina I cardíaca (cTnl) es detectable en la circulación sanguínea 4-6 horas después de un infarto de miocardio agudo (IMA) y sigue siendo elevada durante varios días después (Mair y

col., Clin Chem 41 (9): 1266-1272, 1995; Larue y col., Clin Chem 39(6):972-979, 1993). Así, la elevación de cTnl cubre las ventanas de diagnóstico de tanto la creatina clnasa-MB (CK-MB) como la lactato deshidrogenasa (Bodor, J Clin Immunoassay 17(1 ):40-44, 1994). Otros estudios han indicado que cTnl tiene una mayor especificidad clínica por lesión miocárdica que CK-MB (Adams y col., Clrculation 88(1): 101 -106, 1993; Apple y col., Clin Chim Acta

237:59-66, 1995).

Debido a su especificidad y sensibilidad cardíaca, la cTnl se ha usado como un marcador fidedigno en la evaluación de pacientes con angina inestable y síndrome coronarlo agudo (SCA) sin elevación del segmento ST. Estudios clínicos previos de pacientes con SCA (Lindahl y col., J Am Coll Cardiol 38:1497-1498, 2001; Venge y col., Am J Cardiol 89:1035-1041, 2002) han mostrado que aumentos menores en los valores de cTnl proporcionan importante información de pronóstico sobre el riesgo de muerte a corto y largo plazo (Galvani y col., Circulation 95:2053-2059, 1997; Animan y col., N Eng J Med 335:1342-1349, 1996; Ottani y col., Am Heart J 40:917-927, 2000; Heidenreich y col., J Am Coll Cardiol 38:478-485, 2001). Por último lugar, la evaluación del pronóstico puede ser útil en identificar pacientes que lo más probablemente se beneficiarán de Intervenciones terapéuticas específicas.

Así, se desea cualquier reactivo y procedimiento para reducir la unión no específica en ensayos heterogéneos para cTnl, conduciendo así al aumento de la sensibilidad de ensayos cTnl.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Para este fin, la Invención proporciona un reactivo de ¡nmunoensayo que comprende un agente de unión al analito en un diluyente, y sulfato de condroltlna en una cantidad suficiente para reducir la unión no específica en un ensayo de una muestra para el analito, en el que el analito es troponina I, en el que el agente de unión al analito es un anticuerpo para el analito o un receptor para el analito.

En una realización presentemente preferida, el analito es troponina I, el agente de unión al analito es un anticuerpo monoclonal antl-troponlna I y el glucosamlnogllcano es sulfato de condroitina.

Adlclonalmente se proporciona una composición de muestra que comprende una muestra que va a ensayarse para la presencia de un analito, un agente de unión al analito en un diluyente y sulfato de condroitina en una cantidad suficiente para reducir la unión no específica en un ensayo de la muestra para el analito, en la que el analito es troponina I, en la que el agente de unión al analito es un anticuerpo para el analito o un receptor para el analito.

En una realización presentemente preferida, la muestra es suero o plasma con EDTA, el analito es troponina I, el agente de unión al analito es un anticuerpo monoclonal anti-troponina I y el glucosaminoglicano es sulfato de condroitina.

También se proporcionan procedimientos de detección de troponina I en una muestra, usando sulfato de condroitina para reducir la unión no específica en el procedimiento. El procedimiento comprende combinar una muestra que va a analizarse para la presencia de un analito con sulfato de condroitina y un agente de unión al analito en un diluyente, de manera que se forme un complejo de cualquier analito presente en la muestra y el agente de unión al analito, en los que el sulfato de condroitina reduce la unión no específica en el procedimiento, y detección del complejo resultante de manera que se detecte el analito. En el procedimiento, el analito es troponina I, y el glucosaminoglicano es sulfato de condroitina,... [Seguir leyendo]

1. Un reactivo de inmunoensayo que comprende:

un agente de unión al analito en un diluyente; y sulfato de condroitina en una cantidad suficiente para reducir la unión no específica en un ensayo de una muestra para el analito,

en el que el analito es troponina I, en el que el agente de unión al analito es un anticuerpo para el analito o un receptor para el analito.

2. El reactivo de inmunoensayo de la reivindicación 1, en el que el sulfato de condroitina está presente en una cantidad de 0,25 mg/ml a 4 mg/ml.

3. El reactivo de inmunoensayo de la reivindicación 1, en el que el sulfato de condroitina está presente en una cantidad de 1 mg/ml.

4. El reactivo de inmunoensayo de la reivindicación 1, en el que el agente de unión al analito es un anticuerpo.

5. Una composición de muestra que comprende:

una muestra que va a ensayarse para la presencia de un analito; y el reactivo de inmunoensayo de la reivindicación 1, en el que el analito es troponina I.

6. La composición de muestra de la reivindicación 5, en la que la muestra es una muestra de suero.

7. La composición de muestra de la reivindicación 5, en la que la muestra es una muestra de plasma que contiene ácido etilendiaminatetraacético.

8. La composición de muestra de la reivindicación 5, en la que el agente de unión al analito es un anticuerpo.

9. Un procedimiento de detección de un analito en una muestra, comprendiendo el procedimiento:

combinar una muestra que va a ensayarse para la presencia de un analito con el reactivo de inmunoensayo de la reivindicación 1 de manera que se forme un complejo de cualquier analito presente en la muestra y el agente de unión al analito; y detectar el complejo resultante de manera que se detecte el analito, en el que el analito es troponina I.