Péptidos para la discriminación de priones.

Un procedimiento para la detección in vitro de PrPSc que comprende:

poner en contacto una muestra con un péptido, que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 6 (NWCKRGRKNCKTH), y un anticuerpo específico del prion, en la que el péptido y el anticuerpo específico del prion se unen al PrPSc, y detectar PrPSc.

Péptidos para la discriminación de priones I. Antecedentes Las enfermedades priónicas o encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE) han captado el interés de la comunidad científica, no sólo porque desafiaron el pensamiento convencional acerca de la naturaleza de los agentes infecciosos, sino también debido a la amenaza potencialmente grave que representan para la salud pública en la seguridad de alimentos y sangre. Además, en los últimos años se ha puesto de relieve dramáticamente la posibilidad de la transmisión de la enfermedad entre animales y seres humanos por la aparición epidémica de una nueva forma de variante de la enfermedad: vCJD. La presente invención describió el uso de péptidos sintéticos para el diagnóstico de enfermedades de tipo Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (TSE) en animales y seres humanos.

Priones - Un agente patógeno que causa TSE

Las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (TSEs) comprenden un grupo de enfermedades neurodegenerativas fatales de rápido avance que afectan tanto a seres humanos como a animales. Las TSEs poseen características clínicas y neuropatológicas que incluyen demencia devastadora, signos piramidales y extrapiramidales con mioclono, cambios espongiformes multifocales, astrogliosis, placas de amiloide, pérdida neuronal, ausencia de reacción inflamatoria y usualmente se caracterizan por un largo período de incubación.

Una vez se sugirió que las enfermedades de tipo TSE podrían ser causadas por "virus lentos" o viroides (Gajdusek 1977) . Sin embargo, la extrema resistencia de la infectividad del scrapie a la radiación, las nucleasas y otros reactivos que dañan los materiales genéticos no es coherente con la teoría del "virus". Todas estas características "inusuales" del agente infeccioso de TSE llevaron a que el Dr. Stanley Prusiner propusiera el concepto de "priones" en 1982 (Prusiner 1982) . El prion (PrP) , que significa partícula infecciosa proteica libre de ácidos nucleicos, es una glicoproteína presente en seres humanos y animales. La forma celular de esta proteína (PrPC) posee dos sitios de glicosilación con enlace a N y un ancla GPI en el extremo C-terminal. Se ha encontrado más comúnmente en neuronas y, en mucho menor medida, también se ha encontrado en otras células tales como leucocitos, monocitos y plaquetas (Holada 2000) . La forma de enfermedad transmisible scrapie de la proteína priónica (PrPSc) es una isoforma resistente a las proteasas de su precursor celular y se encuentra predominantemente en el cerebro. En un nivel mucho menor, también se ha encontrado en amígdala, bazo y ganglios linfáticos en pacientes con vCJD (Parizek 2001) . Como resultado del concepto de Prusiner del "prion" como agente infeccioso responsable de la enfermedad scrapie y, por extensión, de todas las enfermedades de tipo TSE, surgió la noción de lo que comúnmente se denomina Enfermedades Priónicas para describir una clase de patologías que se cree están ligadas a esta proteína.

La enfermedad priónica humana se conoce como enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) y usualmente afecta a personas de edad avanzada. Dependiendo del fenotipo de enfermedad, (sCJD) esporádica se refiere a la mayoría de los casos de CJD, mientras que aproximadamente el 10% son CJD familiares (fCJD) . Sólo recientemente, ha surgido una nueva variante de CJD (vCJD) que aparece en adultos jóvenes. Desde 1995, se han informado más de 100 casos. Las Enfermedades Priónicas afectan a muchas especies de animales domésticos y salvajes, a cuyas manifestaciones a menudo se les dan nombres únicos, por ejemplo scrapie en ovejas y cabras (McGowan 1922) , enfermedad por consunción crónica (CWD, Williams 1980) en cérvidos y encefalopatía espongiforme bovina (BSE, o enfermedad de la "vaca loca", Wells 1987) en vacunos.

Características de PrPC y PrPSc

Conforme a la hipótesis de "sólo proteína" de Prusiner, el agente patógeno transmisible que causa enfermedades priónicas es una proteína. El principal componente del prion parece ser el PrP plegado anormalmente, designado PrPSc (isoforma "scrapie", específica de la enfermedad) . Se cree que PrPSc se genera a partir de su contraparte normal, PrPC, a través de un cambio en la conformación (Cohen, 1998) . Aunque aún existe ambigüedad con respecto al mecanismo de la conversión, aún se acepta ampliamente que en presencia de PrPSc, el PrPC normal, actuando como sustrato, sufre un cambio en la estructura conformacional, y se convierte en PrPSc a través de un proceso autocatalítico y da como resultado una agregación de PrPSc y formación de bastones de amiloide, causando por lo tanto la muerte celular (Hope 1986, Horwich 1997) . El cambio estructural de PrPC a PrPSc está respaldado en su mayor parte por un cambio conformacional crucial, que involucra un aumento sustancial en la proporción de estructura de lámina Beta de la proteína, posiblemente con una pequeña reducción en la proporción de hélice alfa, indicada por el dicroísmo circular y la espectroscopía infrarroja (Pan 1993, Caughey 1991) . Parece que la eficiencia de la conversión de PrPC en PrPSc depende del grado de homología de secuencia entre los dos confórmeros de PrP. Debido a este mecanismo singular, las enfermedades priónicas pueden transmitirse fácilmente dentro de la misma especie, y cuando la homología de secuencia de PrP es suficiente, de especie a especie (Raymond, 2000) . Por ello, si es correcto, el mecanismo de transmisión propuesto de las enfermedades priónicas proporciona el potencial para desencadenar epidemias por transmisión de estos trastornos cerebrales entre animales y seres humanos.

La resistencia a las proteasas es otra característica que distingue a PrPSc de PrPC. En las células cultivadas y en cerebro o en muestras de muchos pacientes con GSS, PrPSc es más pequeño que su precursor celular PrPC.

Aunque el prion celular y el prion scrapie son dos isoformas del mismo producto genómico de PRNP, PrPC es completamente degradado por tratamiento con la Proteinasa K mientras que PrPSc sufre sólo una digestión limitada. La digestión produce una forma de proteína denominada PrP 27-30, en la que se ha eliminado el extremo Nterminal. Se ha postulado que PrP 27-30 es el núcleo PrPSc requerido para la replicación de PrPSc albergado por PrPC. La molécula priónica tratada con proteasa, PrP 27-30 o PrPres, está estrechamente ligada a la infectividad de scrapie (Gabizon 1988) y proporciona evidencia adicional de que PrPSc es una proteína infecciosa.

Un atributo adicional, quizás asociado al aumento considerable en la estructura de lámina Beta y la simultánea resistencia a las proteasas, es la diferencia observada en la solubilidad entre PrPSc y PrPC. Mientras PrPC es una proteína soluble, la isoforma PrPSc es sumamente insoluble. Además, PrPC se encuentra unida a la superficie de las neuronas a través de una cola GPI con ancla en la membrana (Shyng 1994) mientras que PrPres se encuentra en el citoplasma de las células afectadas (Taraboulos 1990) , muy probablemente asociada a los compartimentos endosómico tardío y lisosómico (Arnold 1995) , y PrPSc también se localiza en agregados amorfos en fracciones enriquecidas de cerebro infectado (Meyer 1986) .

Existe evidencia cada vez mayor que indica una conexión estrecha entre la infectividad de scrapie y PrP 27-30. Aún en las muestras más puras, la relación estimada de moléculas de PrP a unidades infecciosas es de ∼104 a 105 (Horwich 1997, Bolton 2001) . Con semejantes niveles bajos de infectividad, es posible que se requieran para la infectividad otros componentes, co-factores o modificaciones covalentes. Los estudios transgénicos sobre la susceptibilidad de los ratones que expresan PrPC quimérico de ser humano-ratón- sugieren la presencia de al menos un factor huésped distinto de PrPC, provisionalmente denominado factor X, que podría funcionar como una chaperona molecular en la formación de PrPSc (Telling 1995) .

Infectividad y Transmisibilidad de las Enfermedades Priónicas Las enfermedades priónicas son transmisibles. La transmisibilidad de las enfermedades priónicas en animales se han establecido experimentalmente hace tiempo por inoculación de homogenatos cerebrales de animales afectados en animales saludables, tal como el caso del scrapie de oveja a oveja (Cuille 1936) y entre especies a cabra (Pattison 1957) , kuru y CJD de seres humanos a chimpancés (Gajdusek 1966, Gibbs 1968) . El avance significativo fue la exitosa transmisión de scrapie a ratones (Chandler 1961) , que facilitó enormemente la investigación de TSE proporcionando un modelo experimental. La causa de la BSE reciente en... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la detección in vitro de PrPSc que comprende:

poner en contacto una muestra con un péptido, que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 6 (NWCKRGRKNCKTH) , y un anticuerpo específico del prion, en la que el péptido y el anticuerpo 5 específico del prion se unen al PrPSc, y detectar PrPSc.

2. Un procedimiento para la detección in vitro de PrPSc que comprende: proporcionar un soporte sólido que posee unido al mismo un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 6 (NWCKRGRKNCKTH) y un anticuerpo específico del prion, en la que el péptido o el anticuerpo específico del prion se une al PrPSc, poner en contacto el soporte sólido con una muestra, lavar el soporte para eliminar cualquier muestra no unida, poner en contacto el soporte sólido con el otro soporte del péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 6 (NWCKRGRKNCKTH) o el anticuerpo específico del prion, y realizar una etapa de detección para determinar si PrPSc está unido al soporte sólido.

3. Un kit para la detección de PrPSc que comprende un soporte sólido que posee unido al mismo un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 6 (NWCKRGRKNCKTH) o un anticuerpo específico del prion, y el otro soporte del péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 6

(NWCKRGRKNCKTH) o el anticuerpo específico del prion. 20

Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4