Reactivos para ensayos de combinación para antígenos-anticuerpos VHC.

Un inmunoensayo para detectar simultáneamente antígenos del VHC y anticuerpos para el VHC en una muestra,

consistente en:

disponer de un detergente no iónico que incluye óxido de N-alquil-N,N-dimetilamina, un primer par de un antígeno decaptura y un antígeno de detección y un primer par de un anticuerpo de captura y un anticuerpo conjugado, dondedicho antígeno de captura y dicho antígeno de detección comprenden ambos un primer fragmento peptídico de unaprimera proteína del VHC, dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo conjugado se unen específicamente a unasegunda proteína del VHC y dicho antígeno de detección y dicho anticuerpo conjugado comprenden un mediogenerador de señal, que es el mismo en ambos;

poner en contacto dicha muestra en presencia de dicho detergente con dicho antígeno de captura, dicho antígeno dedetección, dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo conjugado, para formar un complejo en sándwich entredicho antígeno de captura, dicho antígeno de detección y un anticuerpo anti-VHC presente en dicha muestra y uncomplejo entre dicho anticuerpo de captura, dicho anticuerpo conjugado y un antígeno del VHC presente en dichamuestra, y

medir una señal generada por dicho medio generador de señal como resultado de la formación de dichos complejos,detectando así simultáneamente antígenos del VHC y anticuerpos para el VHC en dicha muestra.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona, en general, con inmunoensayos para la detección y el diagnóstico de la infección por el VHC. En particular, la presente invención se relaciona con inmunoensayos de combinación, reactivos y kits basados en el uso de un detergente no iónico para la detección simultánea de antígenos VHC y anticuerpos anti-VHC en una muestra.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El virus de la hepatitis C (VHC) , un virus ARN de una sola hélice, es el agente etiológico de la hepatitis no A, no B, transmitida por la sangre. La infección activa crónica con el VHC progresa con frecuencia a cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular. Los estudios epidemiológicos indican que el VHC infecta a más de 170 millones de personas en todo el mundo, con una elevada incidencia de enfermedad crónica que progresa en último lugar (en más de un 50% de los casos) hacia la muerte. Sin embargo, dado que se trata principalmente de una enfermedad transmitida por la sangre, es posible identificar el patógeno en muestras de sangre y eliminar la transmisión de la enfermedad a través de la transfusión sanguínea. Tras la exposición al patógeno VHC, inicialmente no hay evidencia de la presencia del virus, es decir, que no hay ARN vírico ni marcadores serológicos detectables. Se hace referencia a esto como el “período de ventana” (PV) . En general, a los 10 días de la exposición al VHC, se puede detectar el ARN vírico, mientras que los anticuerpos anti-VHC se hacen detectables aproximadamente 70 días después (Busch MP y Dodd RY, Transfusion 40 (10) : 1157-1160, 2000) . Para prevenir la propagación de la infección por el VHC, es extremadamente importante tomar en consideración este hecho observable y establecer una prueba fiable de rastreo en sangre, que estrecharía la ventana de detección. Desde la comercialización de las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (PAN) que detectan el ARN del VHC, se ha reducido dramáticamente el índice de infección por el VHC después de una transfusión. Otros métodos se basan en el rastreo serológico de la sangre para detectar la presencia del antígeno del núcleo del VHC (Ortho HCV Core Antigen ELISA, Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Raritan, New Jersey) o de anticuerpos contra los polipéptidos del VHC (Ortho HCV 3.0 ELISA, Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Raritan, New Jersey) en suero o plasma de pacientes.

Según una investigación realizada por Seme et al. (J. Clin. Virol. 32 (2) : 92-101, 2005) , el ensayo de primera generación para el antígeno del núcleo del VHC detecta la infección por VHC con sensibilidad y límites de detección comparables a las técnicas de ácidos nucleicos (TAN) . Estos ensayos detectan la infección por VHC entre 40 y 50 días antes que los ensayos actuales de tercera generación de rastreo de anticuerpos contra el VHC. Aunque el ensayo de primera generación para el antígeno del núcleo del VHC, diseñado para rastrear sangre, ha reducido significativamente el período de ventana, sólo detecta antígeno del núcleo en la fase de preseroconversión o de postseroconversión temprana. Además, el ensayo de primera generación para el antígeno del núcleo del VHC no puede detectar el antígeno del núcleo cuando el antígeno forma inmunocomplejos con anticuerpos anti-núcleo en la fase de seroconversión tardía. Claramente, es deseable disponer de un ensayo de serología combinada que pueda detectar el antígeno del núcleo del VHC en la fase de preseroconversión, así como anticuerpos anti-VHC en la fase de seroconversión, estrechando así el PV significativamente. Esta prueba de serología combinada puede ser especialmente un método valioso de rastreo de sangre en escenarios en los que no se puede llevar a cabo la prueba TAN debido a falta de equipamiento o de competencia.

Dicho ensayo combinado de antígenos y anticuerpos VHC representará una mejora significativa sobre el método actual de rastreo serológico de sangre de tercera generación (Ortho HCV 3.0 ELISA, Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Raritan, New Jersey) con respecto al estrechamiento del PV. US 2003/049608 A1 y US 2003/152948 A1 describen un ensayo de combinación para antígenos-anticuerpos de la Hepatitis C para la detección precoz de la infección, en donde se detecta el anticuerpo utilizando un formato indirecto, es decir, utilizando un antígeno de captura y un anticuerpo anti-IgG secundario marcado (Ag-Ab-2º Ab) . Sin embargo, uno de los desafíos para que el ensayo combinado de antígeno y anticuerpo sea eficaz es seleccionar un detergente apropiado para romper los viriones del VHC y liberar el antígeno sin interferir con la captura de los anticuerpos anti-VHC por antígenos VHC recombinantes.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se dirige a inmunoensayos de combinación, reactivos y kits para la detección simultánea de antígenos del VHC y de anticuerpos anti-VHC en una muestra.

La singularidad de los inmunoensayos de combinación de la presente invención radica principalmente en el uso de un detergente no iónico que expone o libera de manera efectiva el antígeno del núcleo del VHC a partir de viriones en una muestra sin ningún procesamiento previo de la muestra, y además no interfiere con la captura de anticuerpos anti-VHC por antígenos VHC recombinantes, permitiendo así la medición simultánea del antígeno del núcleo del VHC y de anticuerpos anti-VHC.

Los detergentes no iónicos adecuados para uso en los ensayos de combinación de la presente invención son miembros de la familia de los óxidos de N-alquil-N, N-dimetilamina. En una realización preferida, el ensayo de combinación emplea N-óxido de laurildimetilamina (LDAO) . En otras realizaciones, se emplea un derivado o equivalente funcional o químico de la LDAO.

Por consiguiente, la presente invención proporciona inmunoensayos de combinación en diversos formatos y reactivos y kits relacionados para la detección simultánea de antígenos del VHC y de anticuerpos anti-VHC en una muestra.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se dirige a inmunoensayos de combinación para antígenos-anticuerpos VHC y métodos, reactivos y kits relacionados.

Los inmunoensayos de combinación o ensayos “combo” para antígenos-anticuerpos VHC se refieren a inmunoensayos que detectan simultáneamente tanto antígenos del VHC como anticuerpos anti-VHC en una muestra en un solo ensayo. Los métodos de ensayo de combinación antígeno/anticuerpo se basan en la identificación y el uso de anticuerpos y antígenos VHC antigénicos e inmunogénicos que están presentes durante las fases iniciales de la seroconversión del VHC, aumentando así la precisión de la detección y reduciendo la incidencia de resultados falsos durante el período de ventana.

La presente invención se basa, al menos en parte, en la identificación de detergentes no iónicos adecuados y efectivos para uso en un inmunoensayo de combinación para la detección sensible y precisa de la infección precoz por el VHC. Dichos detergentes rompen eficazmente las partículas víricas del VHC en una muestra de ensayo y, como resultado, el antígeno del núcleo liberado es capturado y detectado eficazmente por sondas de anticuerpos monoclonales. Al mismo tiempo, los detergentes no tienen ningún impacto negativo sobre la detección de anticuerpos ya sea por lixiviación de los antígenos recombinantes depositados sobre la fase sólida o por interferencia con la captura de anticuerpos anti-VHC durante el ensayo de combinación. Por lo tanto, los ensayos de combinación proporcionados por la presente invención permiten la detección simultánea tanto de antígenos del VHC (incluyendo el antígeno del núcleo) como de anticuerpos anti-VHC en una muestra en un solo ensayo. En comparación con los ensayos existentes, incluidos los ensayos dirigidos a la detección de antígenos del VHC o de anticuerpos anti-VHC por separado, los ensayos de combinación de la presente invención obvian la necesidad de realizar dos ensayos independientes y proporcionan una mayor sensibilidad y especificidad para la detección del VHC.

Según la presente invención, como detergentes no iónicos adecuados para uso en un inmunoensayo de combinación, se incluyen miembros de la familia de los óxidos de N-alquil-N-alquil’-N-metilamina, que también se conocen como detergentes zwitteriónicos. Los grupos alquilo generalmente contienen no más de 15 átomos de carbono cada uno.

En una realización, el detergente es un óxido de N-alquil-N-alquil’-N-metilamina donde el grupo alquilo es un grupo alquilo monocatenario o ramificado de 9 a 13 átomos de carbono y el otro grupo alquilo (“el grupo alquilo”) es un grupo alquilo... [Seguir leyendo]

1. Un inmunoensayo para detectar simultáneamente antígenos del VHC y anticuerpos para el VHC en una muestra, consistente en:

disponer de un detergente no iónico que incluye óxido de N-alquil-N, N-dimetilamina, un primer par de un antígeno de captura y un antígeno de detección y un primer par de un anticuerpo de captura y un anticuerpo conjugado, donde dicho antígeno de captura y dicho antígeno de detección comprenden ambos un primer fragmento peptídico de una primera proteína del VHC, dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo conjugado se unen específicamente a una segunda proteína del VHC y dicho antígeno de detección y dicho anticuerpo conjugado comprenden un medio generador de señal, que es el mismo en ambos; poner en contacto dicha muestra en presencia de dicho detergente con dicho antígeno de captura, dicho antígeno de detección, dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo conjugado, para formar un complejo en sándwich entre dicho antígeno de captura, dicho antígeno de detección y un anticuerpo anti-VHC presente en dicha muestra y un complejo entre dicho anticuerpo de captura, dicho anticuerpo conjugado y un antígeno del VHC presente en dicha muestra, y medir una señal generada por dicho medio generador de señal como resultado de la formación de dichos complejos, detectando así simultáneamente antígenos del VHC y anticuerpos para el VHC en dicha muestra.

2. Un kit para detectar simultáneamente antígenos del VHC y anticuerpos para el VHC en una muestra, que comprende un detergente no iónico que incluye óxido de N-alquil-N, N-dimetilamina, un primer par de un antígeno de captura y un antígeno de detección y un primer par de un anticuerpo de captura y un anticuerpo conjugado, donde dicho antígeno de captura y dicho antígeno de detección comprenden un primer fragmento peptídico de una primera proteína del VHC, dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo conjugado se unen específicamente a una segunda proteína del VHC y dicho antígeno de detección y dicho anticuerpo conjugado comprenden un medio generador de señal, que es el mismo en ambos.

3. El inmunoensayo de la reivindicación 1 o el kit de la reivindicación 2, donde dicho óxido de N-alquil-N, Ndimetilamina se caracteriza por la fórmula CH3- (CH2) n-N+- (CH3) 2O-, donde n está dentro del rango de 9 a 13.

4. El inmunoensayo o el kit de la reivindicación 3, donde dicho óxido de N-alquil-N, N-dimetilamina es N-óxido de laurildimetilamina (LDAO) .

5. El inmunoensayo de la reivindicación 1 o el kit de la reivindicación 2, donde dichas primera proteína del VHC y segunda proteína del VHC son independientemente seleccionadas entre el grupo consistente en el antígeno del núcleo, E1, E2, NS2, NS3, NS4 y NS5.

6. El inmunoensayo de la reivindicación 1 o el kit de la reivindicación 2, donde dicha primera proteína del VHC y dicha segunda proteína del VHC son las mismas y dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo conjugado se unen a una región de dicha segunda proteína del VHC fuera de dicho primer fragmento peptídico.

7. El inmunoensayo o el kit de la reivindicación 6, donde dicha primera proteína del VHC y dicha segunda proteína del VHC son ambas el antígeno del núcleo del VHC.

8. El inmunoensayo de la reivindicación 1, donde se dispone de un segundo par de un antígeno de captura y un antígeno de detección, donde dicho antígeno de captura y dicho antígeno de detección del segundo par comprenden ambos un segundo fragmento peptídico de una proteína del VHC, donde dicho segundo fragmento peptídico es diferente de dicho primer fragmento peptídico.

9. El kit de la reivindicación 2, que además incluye un segundo par de un antígeno de captura y un antígeno de detección, donde dicho antígeno de captura y dicho antígeno de detección del segundo par comprenden un segundo fragmento peptídico de una proteína del VHC, donde dicho segundo fragmento peptídico es diferente de dicho primer fragmento peptídico.

10. El inmunoensayo de la reivindicación 8 o el kit de la reivindicación 9, donde dicho primer fragmento peptídico y dicho segundo fragmento peptídico derivan de diferentes proteínas del VHC.

11. El inmunoensayo o el kit de la reivindicación 10, donde al menos uno de dicho primer fragmento peptídico o dicho segundo fragmento peptídico es un fragmento del antígeno del núcleo del VHC.

12. El inmunoensayo de la reivindicación 1 o el kit de la reivindicación 2, donde dicho anticuerpo de captura en dicho primer par comprende dos o más anticuerpos.

13. El inmunoensayo de la reivindicación 1 o el kit de la reivindicación 2, donde se dispone de un segundo par de un anticuerpo de captura y un anticuerpo conjugado, donde dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo conjugado

en dicho segundo par se unen específicamente a dicha segunda proteína del VHC o a una proteína del VHC diferente.

14. El inmunoensayo de la reivindicación 1 o el kit de la reivindicación 2, donde dicho antígeno de captura y dicho anticuerpo de captura están unidos a una fase sólida.