Uso de líquidos iónicos para la extracción de proteínas.

Procedimiento para la extracción de proteínas, fragmentos de proteínas y/o péptidos de muestras biológicas,

caracterizado por que como agente de extracción se emplean líquidos iónicos de fórmula general K+A-.

Uso de líquidos iónicos para la extracción de proteínas

La presente invención se refiere a un procedimiento para la extracción de proteínas, fragmentos de proteínas y/o péptidos de muestras biológicas, empleándose como agente de extracción líquidos iónicos de fórmula general K+A'.

La determinación referente al análisis de proteínas ha obtenido una importancia creciente en medicina. Esto se refiere en particular al análisis de muestras de tejido para detectar indicios de una enfermedad o una alteración patológica. Con este fin se investigan análisis del proteoma total de la célula. Para ello, es esencial extraer cuantitativamente todas las proteínas de una muestra dada, ya que sólo el análisis de todas las proteínas implicadas en su totalidad permite sacar conclusiones sobre las enfermedades y su origen.

Por consiguiente, el objetivo consistió en proporcionar procedimientos mediante los cuales se puedan extraer proteínas de muestras biológicas para después poder analizarlas.

Por consiguiente, son objeto de la presente invención procedimientos para la extracción de proteínas, fragmentos de proteínas y/o péptidos de muestras biológicas, empleándose como agente de extracción líquidos iónicos de fórmula general K+A'.

Los líquidos iónicos o sales líquidas son especies iónicas que se componen de un catión orgánico y un anión, por lo general, inorgánico. No contienen moléculas neutras y presentan en su mayoría puntos de fusión inferiores a 373 K.

Actualmente, el tema de los líquidos iónicos se investiga de un modo intensivo, ya que las posibilidades de aplicación son diversas. Son artículos de resumen sobre los líquidos iónicos, por ejemplo, R. Sheldon Catalytic reactions in ionio liquids, Chem. Commun., 2001, 2399-2407; M.J. Earle, K.R. Sed- don Ionio liquids. Green solvent for the future, Puré Appl. Chem., 72 (2000), 1391-1398; P. Wasser- scheid, W. Keim lonische Flüssigkeiten - neue Lósungen für die Übergangsmetallkatalyse, Angew. Chem., 112 (2000), 3926-3945; T. Welton Room temperature ionio liquids. Solvents for synthesis and catalysis, Chem. Rev., 92 (1999), 2071-2083 o R. Hagiwara, Ya. Ito Room temperature ionio liquids of alkylimidazolium cations and fluoroanions, J. Fluoríne Chem., 105 (2000), 221-227).

El documento WO 2004 024279 revela un uso de líquidos iónicos para la solubilizacíón en particular de proteínas hidrófobas.

Sorprendentemente se ha encontrado que los líquidos iónicos de fórmula general K+A' son apropiados para extraer proteínas, fragmentos de proteínas y/o péptidos de muestras biológicas. Esto también es válido cuando las muestras biológicas están fijadas, como es el caso normalmente en la preparación de muestras biológicas. El procedimiento de extracción según la invención se puede emplear también sorprendentemente en muestras fijadas, lo cual amplía enormemente las posibilidades de aplicación del procedimiento. De este modo, con el procedimiento según la invención se pueden tratar de forma universal muestras biológicas para extraer de ellas proteínas, fragmentos de proteínas y/o péptidos. Así, el procedimiento según la invención tiene la ventaja de que los componentes que se tienen que extraer no se degradan, es decir, mantienen su constitución química. Esta es una ventaja esencial frente a los procedimientos conocidos, como los que se describen por ejemplo en el documento W02004/080579, en los cuales las proteínas que se tienen que extraer se deben degradar a péptidos en una etapa proteolítica para después poderlos analizar. Por tanto, en conjunto con el procedimiento según la invención es posible un tratamiento sencillo de muestras biológicas para el aislamiento de proteínas, fragmentos de proteínas y/o péptidos, el cual no estaba disponible a partir del procedimiento descrito por el estado de la técnica.

La extracción de proteínas, fragmentos de proteínas y/o péptidos en el procedimiento según la invención se puede realizar en todas las muestras biológicas conocidas por el especialista. Preferentemente las muestras biológicas son tejidos, como por ejemplo biopsias y preparados histológicos, células, cultivos celulares y/o fluidos corporales, como por ejemplo sangre, plasma, suero, orina, líquido cefalorraquídeo o saliva. La extracción de proteínas de tejidos y cultivos celulares permite en particular la detección de proteínas específicas, por ejemplo para la detección de proteínas que permiten deducir la presencia de enfermedades. Por tanto, el procedimiento según la invención es ventajoso en particular también para muestras interesantes de tejido patológico.

Las muestras biológicas pueden estar fijadas o no estarlo, preferentemente están fijadas. Así, la fijación se puede realizar según todos los métodos conocidos por el especialista, por ejemplo mediante el uso de formalina, glutaraldehído, sustitutos de la formalina, alcoholes, como por ejemplo etanol, meta- nol, isopropanol, o materiales inertes, como por ejemplo parafina, ureas o polímeros. Preferentemente las muestras biológicas se fijan con formalina. La formalina es el agente de fijación más habitual en la

preparación de muestras histológicas y, a causa de su bajo precio y el buen rendimiento de fijación, se emplea en muchos lugares y desde hace ya más de den años. Sin embargo, la fijación con formallna tiene la desventaja de que produce un entrecruzamiento de las proteínas con la matriz de las muestras. Por consiguiente, en general las proteínas se vuelven insolubles y no están disponibles para un análisis posterior. Mediante el uso de líquidos iónicos en el procedimiento según la invención se pueden extraer las proteínas de estas muestras, incluso manteniendo su estructura, para después analizarlas. De este modo se amplía en su viabilidad el método de fijación más habitual con formallna sin restringir las posibilidades del análisis posterior. Por tanto, mediante el uso del procedimiento según la invención ahora también se pueden investigar con el análisis de proteínas moderno muestras que ya se han conservado mucho tiempo empleando formalina, es decir, se suprime una limitación temporal de la capacidad de análisis de las muestras.

En general en el procedimiento según la invención son adecuados todos los líquidos iónicos conocidos por el especialista de fórmula general K+A', por ejemplo con aniones hexafluorofosfato, tetrafluorobora- to o halogenuro. Son ejemplos de líquidos iónicos apropiados trihexil(tetradecil)-fosfoniohexafluoro- fosfato, trihexil(tetradecil)-fosfoniocloruro o trihexil(tetradecil)-fosfoniotetrafluoroborato.

Preferentemente el anión A' del líquido iónico se selecciona del grupo de las ¡midas, en particular aquellas de fórmula general

[N(Rf)2]

donde Rf representa alquilo con 1 a 8 átomos de C parcial o totalmente sustituido con flúor o Rf2X, donde Rf2 representa alquilo con 1 a 8 átomos de C parcial o totalmente sustituido con flúor, y X representa S02 o CO, del grupo de los fluoroalquilfosfatos, en particular aquellos de fórmula general

[PFx(CyF2y+1-zHz)6-x]"

con 1 < x < 6, 1 <y<8y0<z< 2y+1 o de mezclas de los mismos.

Preferentemente Rf es trifluorometilo, pentafluoroetilo, nonafluorobutilo o Rf2SC>2, en particular trlfluo- rometilo o Rf2S02, prefiriéndose en particular que Rf2 sea trifluorometilo. En el caso de los fluoroalquilfosfatos se prefiere x = 3, z = 0ey = 2, 3o 4, siendo muy preferible en particular y = 2. Los fluidos iónicos que contienen los aniones especialmente preferidos [(CF3S02)2N]' o [PF3(C2Fs)3] son particularmente apropiados para la extracción de proteínas, fragmentos de proteínas y/o péptidos en el procedimiento según la invención.

En lo referente a la selección de los cationes K+ del líquido aniónico, no existen limitaciones de por sí. Sin embargo, se trata preferentemente de cationes orgánicos, prefiriéndose en especial cationes amonio, fosfonio, uronio, tiouronio, guanidinio o cationes heterocíclicos.

Los cationes amonio se pueden describir, por ejemplo, mediante la fórmula (1)

[NR4]+ (1),

donde

R representa independientemente entre sí,

H, no pudiendo ser H al mismo tiempo todos los sustituyentes R,

OR, NR2, con la condición de que como máximo un sustituyente R de la fórmula (1) sea OR, NR2, alquilo de cadena lineal o ramificada de 1 a 20 átomos de C,

alquenilo de cadena lineal o ramificada de 2 a 20 átomos de C y uno o varios enlaces dobles, alquinilo de cadena lineal o ramificada de 2 a 20 átomos de C y uno o varios enlaces triples, cicloalquilo saturado, total o parcialmente insaturado, con 3-7 átomos de C, que puede estar sustituido con grupos alquilo con 1-6... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la extracción de proteínas, fragmentos de proteínas y/o péptidos de muestras biológicas, caracterizado por que como agente de extracción se emplean líquidos iónicos de

fórmula general K+A\

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que las muestras biológicas son tejidos, células, cultivos celulares y/o fluidos corporales.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que las muestras biológicas están

fijadas.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que las muestras biológicas están fijadas con formalina.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizado por que los aniones A' del líquido iónico se seleccionan del grupo de las imidas de fórmula general [N(Rf)2]`, representando Rf alquilo con 1 a 8 átomos de C sustituido total o parcialmente con flúor o Rf2X, representando Rf2 alquilo con 1 a 8 átomos de C sustituido total o parcialmente con flúor y X SO2 o CO,

del grupo de los fluoroalquilfosfatos de fórmula general [PFx(CyF2y+i-zHz)6-x]" con 1 < x < 6, 1 < y < 8

y 0 < z < 2y+1 o de las mezclas de los mismos.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizado por que los cationes K+ del líquido iónico se seleccionan del grupo de cationes amonio, fosfonio, uranio, tiouronio,

guanidinio o cationes heterocíclicos.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones de la 1 a la 6, caracterizado por que la extracción se realiza a temperaturas de 0 a 95°C.