Uso de citosina desaminasas para disminuir la transferencia de retroelementos desde cerdos a seres humanos.

Un cerdo transgénico, cuyas células nucleadas comprenden un constructo de ácido nucleico,

comprendiendo dicho constructo de ácido nucleico una unidad transcripcional que comprende una región reguladora operablemente enlazada a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citosina desaminasa no porcina, en el que la expresión de dicho polipéptido de citosina desaminasa no porcina en al menos algunas de las células del cerdo da como resultado, al cocultivarlas con células humanas, una menor capacidad de dichas células para transmitir retrovirus endógenos porcinos a las células humanas, en el que dicha citosina desaminasa no porcina se selecciona del grupo que consiste en APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3E, APOBEC3F, APOBEC3G, y APOBEC3H.

Uso de citosina desaminasas para disminuir la transferencia de retroelementos desde cerdos a seres humanos

CAMPO TÉCNICO

Esta invención se refiere a cerdos transgénicos y células porcinas que tienen una menor capacidad de transmitir retroelementos, tales como retrovirus endógenos porcinos, a células y tejidos no porcinos, y más particularmente a cerdos transgénicos y células porcinas que contienen citosina desaminasas no porcinas.

ANTECEDENTES

El tratamiento de la diabetes sigue siendo una carga importante para pacientes y sus familias, experimentando hasta el 50% de los pacientes complicaciones secundarias devastadoras debido a un tiempo de vida de exposición a niveles elevados de glucosa. Actualmente, la única manera para restaurar y sostener insulina sin el riesgo asociado de hiper- o hipoglucemia es sustituir las células productoras de insulina del paciente, los islotes de Langerhans: ya sea mediante el trasplante de un páncreas vascularizado o mediante la infusión de islotes aislados. Sin embargo, los donantes de páncreas humanos adecuados son muy raros. Los cerdos proporcionan una fuente potencialmente ilimitada de islotes para xenotransplante a pacientes diabéticos, y se puede desarrollar hasta el punto de aplicabilidad clínica, potencialmente bien antes de otras tecnologías en desarrollo, tales como células madre.

El potencial de transmisión de virus desde el tejido donante al tejido hospedante sigue siendo un impedimento para el uso de xenotransplante para el tratamiento de diabetes. Aunque la bioseguridad y ensayo rigurosos pueden eliminar la mayoría de los agentes procedentes de cerdos donantes potenciales, un agente en particular es recalcitrante a este enfoque. La mayoría de, quizá todos, los genomas de vertebrados, incluidos cerdos y seres humanos, poseen secuencias de ácido nucleico móviles por infecciones retrovíricas previas. Aunque la mayoría de éstas son funcionalmente inactivas, las células de cerdo contienen varios tipos de retroelementos activos, denominados retrovirus endógenos porcinos (PERVs) . Estos agentes son generalmente inocuos al cerdo, pero son un problema importante para el xenotransplante. En condiciones de laboratorio en las que se cocultivan células humanas y de cerdos, se ha demostrado la transmisión de los PERVs desde el tejido de cerdo a tejido humano (Patience et al. (1997) Nat Med 3, 282-286) . No está claro cuál, si esta transmisión tendría alguna ramificación para un paciente, pero la posibilidad teorizada de que PERVs solos o en combinación con agentes humanos pudiesen provocar enfermedad ha surgido como un obstáculo principal para la aplicación ampliamente extendida del xenotransplante.

SUMARIO

La invención como se define en las reivindicaciones se basa en la expresión de polipéptidos de citosina desaminasas no porcinas en células y tejidos de cerdos. Como se describe aquí, la expresión de citosina desaminasas no porcinas (por ejemplo, citosina desaminasas humanas) en células y tejidos porcinos puede facilitar el control de la transmisión de retroelementos, tales como PERVs, a células humanas. Como resultado, las células y tejidos de cerdos que contienen citosina desaminasas no porcinas tienen capacidad reducida de transmitir PERVs a células humanas y, como tal, pueden reducir los riesgos asociados con el xenotransplante de la transferencia génica entre especies.

En un aspecto, la invención como se define en las reivindicaciones presenta un constructo de ácido nucleico que incluye una unidad transcripcional, incluyendo la unidad transcripcional una región reguladora porcina enlazada operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citosina desaminasas no porcinas. Una repetición invertida de un transposón puede flanquear cada lado de la unidad transcripcional. Un elemento aislante también puede flanquear cada lado de la unidad transcripcional. El constructo de ácido nucleico puede incluir además una secuencia de ácido nucleico que codifica una transposasa.

El polipéptido de citosina desaminasas de la descripción se puede seleccionar del grupo que consiste en AID, APOBEC1, APOBEC2, APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3E, APOBEC3F, APOBEC3G, y APOBEC3H. Por ejemplo, en la invención, el polipéptido de citosina desaminasas puede ser un polipéptido de APOBEC3F, tal como un polipéptido de APOBEC3F humano, o puede ser un polipéptido de APOBEC3G, tal como un polipéptido de APOBEC3G humana. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico codifica al menos dos polipéptidos de citosina desaminasas (por ejemplo, un polipéptido de APOBEC3F y un polipéptido de APOBEC3G) . La región reguladora porcina puede ser un promotor constitutivo o un promotor específico de tejido.

En otro aspecto, la invención como se define en las reivindicaciones presenta una célula porcina aislada que incluye un constructo de ácido nucleico, incluyendo el constructo de ácido nucleico una región reguladora enlazada operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citosina desaminasas no porcinas. La célula puede ser una célula embriónica, una célula porcina fetal (por ejemplo, un fibroblasto) , una célula porcina de adulto (por ejemplo, un fibroblasto dérmico) , una célula germinal (por ejemplo, un oocito o un óvulo) , una célula madre (por ejemplo, una célula madre adulta o una célula madre embriónica) , o una célula progenitora.

La invención como se define en las reivindicaciones también presenta una célula porcina aislada que incluye una citosina desaminasa no porcina. La célula puede incluir además un ácido nucleico que codifica la citosina desaminasa no porcina. El polipéptido de citosina desaminasas de la descripción se puede seleccionar del grupo que consiste en AID, APOBEC1, APOBEC2, APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3E, APOBEC3F, APOBEC3G, y APOBEC3H. Por ejemplo, en la invención, el polipéptido de citosina desaminasas puede ser un polipéptido de APOBEC3F, tal como un polipéptido de APOBEC3F humano, o puede ser un polipéptido de APOBEC3G, tal como un polipéptido de APOBEC3G humana. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico codifica al menos dos polipéptidos de citosina desaminasas (por ejemplo, un polipéptido de APOBEC3F y un polipéptido de APOBEC3G) . La región reguladora puede ser un promotor constitutivo o un promotor específico de tejido.

En otro aspecto, la invención como se define en las reivindicaciones presenta un cerdo transgénico, células derivadas del cerdo transgénico, tejido aislado del cerdo transgénico, y progenie del cerdo transgénico. Las células nucleadas del cerdo incluyen un constructo de ácido nucleico, el cual incluye una unidad transcripcional que incluye una región reguladora operablemente enlazada a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citosina desaminasas no porcinas. La expresión del polipéptido de citosina desaminasas no porcinas en al menos algunas de las células del cerdo da como resultado, al cocultivarlas con células humanas, una menor capacidad de las células para transmitir retrovirus endógenos porcinos a las células humanas. La región reguladora puede ser un promotor constitutivo o un promotor específico de tejido. Un elemento aislante y una repetición invertida de un transposón pueden flanquear cada lado de la unidad transcripcional. El polipéptido de citosina desaminasas de la descripción se puede seleccionar del grupo que consiste en AID, APOBEC1, APOBEC2, APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3E, APOBEC3F, APOBEC3G, y APOBEC3H. Por ejemplo, en la invención, el polipéptido de citosina desaminasas puede ser un polipéptido de APOBEC3F, tal como un polipéptido de APOBEC3F humano, o puede ser un polipéptido de APOBEC3G, tal como un polipéptido de APOBEC3G humano.

En otro aspecto, la descripción presenta un método para obtener un cerdo transgénico. El método incluye introducir una célula de cerdo transgénico en un oocito de cerdo enucleado para establecer una célula combinada, la célula de cerdo transgénico incluye un constructo de ácido nucleico, el cual incluye una unidad transcripcional que incluye una región reguladora enlazada operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citosina desaminasas no porcinas; producir un embrión porcino a partir de la célula combinada; transferir el embrión porcino a una hembra receptora; y permitir que el embrión porcino se desarrolle en la hembra receptora para producir el cerdo transgénico. Un elemento aislante y una repetición invertida de un transposón pueden flanquear cada lado de la unidad transcripcional.

La descripción también presenta un método para obtener un cerdo transgénico.... [Seguir leyendo]

1. Un cerdo transgénico, cuyas células nucleadas comprenden un constructo de ácido nucleico, comprendiendo dicho constructo de ácido nucleico una unidad transcripcional que comprende una región reguladora operablemente enlazada a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citosina desaminasa no porcina, en el

que la expresión de dicho polipéptido de citosina desaminasa no porcina en al menos algunas de las células del cerdo da como resultado, al cocultivarlas con células humanas, una menor capacidad de dichas células para transmitir retrovirus endógenos porcinos a las células humanas, en el que dicha citosina desaminasa no porcina se selecciona del grupo que consiste en APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3E, APOBEC3F, APOBEC3G, y APOBEC3H.

2. El cerdo transgénico de la reivindicación 1, en el que dicha región reguladora es un promotor constitutivo.

3. El cerdo transgénico de la reivindicación 1, en el que dicha región reguladora porcina es un promotor específico de un tejido o específico de un órgano.

4. El cerdo transgénico de la reivindicación 1, en el que un elemento aislante y una repetición invertida de un transposón flanquean cada lado de dicha unidad transcripcional.

5. El cerdo transgénico de la reivindicación 1, en el que dicha citosina desaminasa no porcina es APOBEC3F humana o APOBEC3G humana.

6. Células nucleadas aisladas derivadas del cerdo transgénico de la reivindicación 1 que comprenden un constructo de ácido nucleico, comprendiendo dicho constructo de ácido nucleico una unidad transcripcional que comprende una región reguladora enlazada operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citosina desaminasa no porcina, en el que dicha citosina desaminasa no porcina se selecciona del grupo que consiste en APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3E, APOBEC3F, APOBEC3G, y APOBEC3H.

7. Tejido aislado del cerdo transgénico de la reivindicación 1, cuyas células nucleadas comprenden un constructo de ácido nucleico, comprendiendo dicho constructo de ácido nucleico una unidad transcripcional que comprende una región reguladora enlazada operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citosina desaminasa no porcina, en el que dicha citosina desaminasa no porcina se selecciona del grupo que consiste en APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3E, APOBEC3F, APOBEC3G, y APOBEC3H.

8. Progenie de dicho cerdo transgénico de la reivindicación 1, cuyas células nucleadas comprenden un constructo de ácido nucleico, comprendiendo dicho constructo de ácido nucleico una unidad transcripcional que comprende una región reguladora enlazada operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citosina desaminasa no porcina, en el que dicha citosina desaminasa no porcina se selecciona del grupo que consiste en APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3E, APOBEC3F, APOBEC3G, y APOBEC3H.

9. Un método in vitro para disminuir la capacidad de células de cerdo de transmitir retrovirus endógenos porcinos a células humanas, que comprende cocultivar las células nucleadas aisladas de la reivindicación 6 con las células humanas.

10. Las células nucleadas aisladas de la reivindicación 6 o el tejido de la reivindicación 7, para uso en xenotransplante.