Sistema modelo de tumor útil para estudiar el cáncer polietápico.

Un método de preparación de un sistema modelo de tumor en un ratón inmunodeficiente,

en cuyo sistema células transformadas privadas de adhesión se han administrado por vía subcutánea a un ratón inmunodeficiente y se ha dejado que se metastaticen en el ratón inmunodeficiente durante un periodo de aproximadamente 4 semanas a aproximadamente 6 semanas después de transformación in vivo; habiéndose preparado dichas células transformadas privadas de adhesión por:

a. preparación de las células privadas de adhesión por tripsinización de células fibroblastos de rata adherentes normales, F111; y

b. suspensión de dichas células fibroblastos de rata privadas de adhesión (F111) del paso 'a' sobre una superficie recubierta de agarosa al 0,8 a 1% en medio de Eagle Modificado por Dulbecco que contiene 8 a 10% de Suero de Ternero Fetal (FCS) para obtener células fibroblastos transformadas privadas de adhesión.

Sistema modelo de tumor útil para estudiar el cáncer polietápico

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método de desarrollo de un Sistema Modelo de Tumor. La invención se refiere a un sistema modelo de tumor con células privadas de adhesión. Esta invención proporciona la detección primaria de la transformación de células privadas de adhesión y tumorigenicidad. Las células privadas de adhesión son susceptibles de metastatizarse en sitios distantes y el sistema modelo incluye tanto la formación de tumor como la metástasis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las interacciones célula-matriz y célula-célula son determinantes fisiológicos importantes del crecimiento, la supervivencia y la transformación de las células. La adhesión de las células a la matriz extracelular (ECM) por la vía de integrinas influye también crucialmente en la organización del citoesqueleto. La fijación de ligandos a integrinas conduce a la aglomeración de las integrinas y el reclutamiento de filamentos de actina y proteínas de señalización al dominio citoplásmico de la integrina (Hynes, R.O., 2002. Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110, 673-687) . Estos complejos proporcionan señalización de fuera adentro para regular diversas funciones celulares que equilibran los caminos de supervivencia y muerte tanto en las células normales como en las tumorígenas (Assoian RK, Schwartz MA. 2001. Coordinate signaling by integrins and receptor tyrosine kinases in the regulation of G1 phase cell-cycle progression. Curr Opin Genet Dev. 11 (1) : 48-53) . La mayoría de las células dependientes de adhesión sufren apoptosis después de la privación de sustrato. La ligación de integrinas puede salvar estas células, lo que demuestra que las integrinas están involucradas en la estimulación de los mecanismos resistentes a la apoptosis y permiten que las células sufran transformación (Rajeswari, J y Pande. G. 2002. The significance of ï?¡5ï?¢1 integrin dependent and independent cytoskeleton organization in cell transformation and survival. Cell Biol. Int. 26, 1043-1055) . Las integrinas proporcionan también señales para desprenderse de los tumores primarios, invadir y colonizar en sitios secundarios durante la metástasis (Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S.L., Matsudaira, P., Baltimore, D., and Darnell, J. 2002. Molecular Cell Biology, 4ª edición, W.H. Freeman and Company, Nueva York, pp. 751-792, 817-822, 970-988, 1056-1082 y Seiki, M., Koshikawa, N., Yana, I., 2003. Role of pericellular proteolysis by membranetype1 matrix metalloproteinase in cancer invasion and angiogenesis. Cancer and Metastasis Reviews. 22 (2) , 129-143, Ledezma, 2004) y la angiogénesis (Stupack DG, Cheresh DA. Integrins and angiogenesis. [2004 Curr Top Dev. Biol. 4, 207-38.) . En contraste, algunas células cancerosas mueren en lugar de colonizar en sitios distantes (Rust et al., 2002) . De ahí que los cambios en los perfiles de expresión de integrinas puedan influir espectacularmente en la progresión de tumores malignos por inducción de diversas moléculas de señalización tales como las quinasas Jun (JNKs) , la quinasa P38, Bad y diversas caspasas.

Varios estudios recientes han demostrado la eficacia de las integrinas como indicadores de enfermedades tales como cáncer y angiogénesis. Tanto la regulación creciente como la regulación decreciente de la expresión de integrinas podrían servir como marcadores eficaces en la detección del cáncer. Por ejemplo, la regulación decreciente de α6 y β4 puede contribuir a una mayor tumorigénesis en las células del cáncer de próstata (Bonaccorsi L, Carloni V, Muratori M, Salvadori A, Giannini A, Carini M, Serio M, Forti G, Baldi E. 2000 Endocrinology. 141 (9) , 3172-82) . La expresión de receptores de andrógenos en las células del carcinoma prostático suprime el fenotipo invasivo mediado 45 por la integrina alfa6beta4. Las correlaciones clínicas de biopsias de pacientes con la expresión de integrinas se recapitulan en cierto grado en análisis de roedores y análisis in vitro. Por ejemplo, un estudio de hepatocarcinogénesis en la rata demostró que las integrinas α1 y α5 estaban reguladas en sentido creciente en metástasis de pulmón y diafragma, mientras que las integrinas α1, α2, α3, y α5 estaban reducidas en el carcinoma primario y los nódulos preneoplásticos (Rust WL, Carper RS y Plopper GE. 2002. The promise of integrins as effective targets for anticancer agents. J Biomed Biotechnol.2002; 124-130) .

Los mecanismos reguladores de la supervivencia celular y la apoptosis son de naturaleza muy compleja, implicando numerosos factores y caminos de señalización no solo en el proceso de toma de decisiones de supervivencia (o muerte) , sino también en la ejecución de la apoptosis propiamente dicha. La misma naturaleza compleja es aplicable 55 en lo que respecta a la anoikis, una forma de apoptosis que está regulada en gran parte por interacciones célulamatriz extracelular mediadas por integrinas.

La mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer están asociadas con metástasis. La cascada metastásica es un proceso complejo constituido por varios pasos importantes que incluyen pérdida de arquitectura del tejido, invasión local, invasión en la sangre y los vasos linfáticos, extravasación, establecimiento de los focos secundarios y angiogénesis. La invasión de la matriz extracelular y la propagación metastásica del cáncer a otros tejidos es probable también que refleje la capacidad de las células tumorales para digerir su andamiaje de matriz circundante por secreción de enzimas degradantes de la matriz tales como las metaloproteinasas de la matriz (MMPs) . La invasión de la matriz extracelular y la propagación metastásica del cáncer de colon refleja también probablemente la 65 capacidad de las células tumorales para digerir su andamiaje de matriz circundante por secreción de enzimas degradantes de la matriz tales como las metaloproteinasas de la matriz (MMPs) . Los mecanismos por los cuales las

células del cáncer de colon humano escapan a las limitaciones de crecimiento impuestas a las células normales por aglomeración celular y matrices pericelulares densas no están claros. Sin embargo, los mecanismos por los cuales las células tumorígenas escapan a las limitaciones de crecimiento impuestas a las células normales por aglomeración celular y matrices pericelulares densas no están claros (Un método de modulación de la actividad celular mediada por integrinas y agentes útiles para el mismo. 2001. WO/2001/000677) .

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El cáncer es una enfermedad grave y muy letal. Aunque se han logrado avances en la diagnosis y el tratamiento de ciertos cánceres en los últimos años, hay todavía necesidad del desarrollo de un sistema modelo, que ayude a comprender la naturaleza del cáncer y sea útil en la evaluación de diferentes tipos de fármacos. La presente invención se refiere a la transformación y en particular al cáncer.

Muchos informes han demostrado que las integrinas juegan un papel crucial en el tratamiento del cáncer. Las inte

grinas que se fijan a los péptidos RGD están generalmente sobreexpresadas en los vasos angiogénicos, con inclusión de los de tumores y en lesiones inflamatorias, tales como la artritis reumatoide. En algunos tumores, las células tumorales expresan también integrinas de fijación a RGD. Existe un vasto cuerpo de bibliografía preclínica y clínica acerca del uso de antagonistas de las integrinas basadas en RGD en la enfermedad cardiovascular y el cáncer. (Ruoslahti, E. 2003. RGD stor y : A personal account. A Landmark Essay. Matrix Biology. 22: 459-465) .

A lo largo de la última década, se han publicado y expedido numerosas patentes de utilización de antagonistas αÎβ3 para la prevención y/o el tratamiento del cáncer, demostrando muchos antagonistas resultados positivos preclínicos antiangiogénicos y antitumorales, que utilizan anticuerpos, péptidos RGD, péptidos distintos de RGD, peptidomiméticos. (Hsu et.al. 2007. Integrin ï?¡vï?¢3 antagonists for Anti-angiogenic cancer treatment. Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discover y , 2, 143-158)

La invención descrita en WO/2003/075957 proporciona métodos para identificación de antagonistas de la integrina &alfa; Îβ3, particularmente para anticuerpos que se fijan específicamente al mismo epítopo que Vitaxina (E y/o LM609) , como Vitaxina (E y/o LM609) (Patente núm. (WO/2003/075957) . La prevención y/o el tratamiento del cáncer utilizando antagonistas de la integrina alfa Πβ3 en combinación con otros agentes) .

Sin embargo, muy pocos sistemas modelo se han mostrado en la bibliografía en los... [Seguir leyendo]

1. Un método de preparación de un sistema modelo de tumor en un ratón inmunodeficiente, en cuyo sistema células transformadas privadas de adhesión se han administrado por vía subcutánea a un ratón inmunodeficiente y se ha dejado que se metastaticen en el ratón inmunodeficiente durante un periodo de aproximadamente 4 semanas a aproximadamente 6 semanas después de transformación in vivo; habiéndose preparado dichas células transformadas privadas de adhesión por:

a. preparación de las células privadas de adhesión por tripsinización de células fibroblastos de rata adherentes 10 normales, F111; y b. suspensión de dichas células fibroblastos de rata privadas de adhesión (F111) del paso 'a' sobre una superficie recubierta de agarosa al 0, 8 a 1% en medio de Eagle Modificado por Dulbecco que contiene 8 a 10% de Suero de Ternero Fetal (FCS) para obtener células fibroblastos transformadas privadas de adhesión.

2. El método conforme a la reivindicación 1, en el cual la transformación in vitro de células no adherentes del paso b se confirma por el ensayo de formación de colonias en agar blando.

3. El método conforme a la reivindicación 1, en el cual la detección de la localización de la metástasis comprende: 20

i. Incrustación en parafina de secciones de muestras de tejido recogidas de órganos seleccionados de un grupo constituido por tumor, pulmón, bazo y riñón del sistema modelo por proceso conocido;

ii. tinción de secciones en parafina del paso (i) con Hematoxilina y Eosina;

iii. detección de metástasis en las secciones de parafina teñidas del paso (ii) por el patrón de tinción 25 diferencial de las células neoplásticas y su penetración en el tejido localizado.

4. El método conforme a la reivindicación 1, que comprende mezclar células privadas de adhesión con medio DMEM que contiene 0, 2-0, 3% de agarosa en suero y extensión de las mismas sobre una superficie recubierta con agar al 0, 8% a 1%.

5. Un método conforme a la reivindicación 1, en el que el ratón utilizado es un ratón lampiño inmunodeficiente.

6. Un método conforme a la reivindicación 1, en el que el mismo es útil para simular la progresión de la

formación de tumor primario, evaluar metástasis o evaluar tumorigénesis. 35

7. Un método conforme a la reivindicación 1, en el que la detección se efectúa en la sangre periférica del ratón inmunodeficiente o en la médula ósea del ratón inmunodeficiente.

8. Un sistema modelo de tumor con células privadas de adhesión, preparado por el método que se reivindica en 40 la reivindicación 1.

9. Un sistema modelo de tumor conforme a la reivindicación 8, útil para la detección de cáncer polietápico.

10. Un sistema modelo de tumor conforme a la reivindicación 8 para uso en la evaluación del efecto de un

tratamiento para el cáncer por determinación del efecto del tratamiento sobre el crecimiento del tumor en el sistema modelo de tumor.

11. Uso de un sistema modelo de tumor conforme a la reivindicación 8 para identificación de diferentes etapas de progresión del cáncer. 50

12. Uso de un sistema modelo de tumor conforme a la reivindicación 8 para desarrollo de terapias antitumorales y diversos fármacos del cáncer en diferentes etapas de cáncer.

13. Uso de un sistema modelo de tumor conforme a la reivindicación 8 para identificación de células 55 metastásicas.