Sistema de expresión que incorpora una secuencia promotora de la cápsida como potenciador de un promotor de citomegalovirus.

Procedimiento in vitro para estimular la expresión de un transgén en una célula hospedadora,

en donde el procedimiento incluye las etapas de:

(a) inserción de una secuencia de un elemento promotor de la cápsida (Pcap) o un complemento inverso de la misma (PcapR) que es al menos idéntica al 80% a cualquiera de las secuencias seleccionadas de las SEQ ID n.º 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22 y 24 en un casete de expresión de mamífero delante (5') de un promotor inmediato/temprano de citomegalovirus (Pcmv) o un elemento promotor del SV40;

(b) inserción del transgén en el vector por detrás (3') del elemento promotor de citomegalovirus o del elemento promotor del SV40;

(c) inserción del casete de expresión en la célula hospedadora; y

(d) hacer que se exprese el transgén.

Sistema de expresión que incorpora una secuencia promotora de la cápsida como potenciador de un promotor de citomegalovirus

Antecedentes de la invención La invención describe un nuevo elemento de expresión potenciador/promotor compuesto de mamífero.

El elemento potenciador/promotor inmediato/temprano de citomegalovirus (Pcmv) es actualmente el elemento promotor de mamífero más fuerte que se conoce, y como tal pone un límite más alto a la expresión de transgenes en los sistemas in vitro e in vivo.

Por lo tanto, sería deseable poder incluir otro elemento más en un vector que permita alcanzar una mayor expresión 10 del transgén.

Compendio de la invención De acuerdo con una primera realización de la invención, se da a conocer un procedimiento in vitro para la estimulación de la expresión de un transgén en una célula hospedadora, en donde el procedimiento incluye las etapas de:

insertar una secuencia de un elemento promotor de la cápsida (Pcap) o de un complemento inverso de la misma (PcapR) que es al menos idéntica al 80% a alguna de las secuencias seleccionadas entre las SEQ ID n.º 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22 y 24 en un casete de expresión de mamífero por delante (en 5') de un promotor inmediato/temprano de citomegalovirus (Pcmv) o de un elemento promotor del SV40;

insertar el transgén en el casete de expresión por detrás (en 3') del elemento promotor de citomegalovirus o del 20 elemento promotor del SV40;

insertar el casete de expresión en la célula hospedadora; y

hacer que se exprese el transgén.

Se puede introducir un intrón de citomegalovirus por detrás (en 3') del Pcmv y se puede introducir un sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (poliA de la bgh) detrás (en 3') del transgén.

El transgén se expresa típicamente en más cantidad que cuando se expresa en el casete de expresión sin las secuencias Pcap o PcapR.

El elemento promotor de la cápsida o el complemento inverso del mismo puede ser de un circovirus tal como el circovirus porcino de tipo 1 (PCV-1) , el circovirus porcino de tipo 2 (PCV-2) , el virus de la enfermedad del pico y las plumas (BFDV) , el circovirus del canario, el circovirus de los colúmbidos, el circovirus del pato, el circovirus del

pinzón, el circovirus del ganso y el circovirus de la gaviota, o un elemento equivalente de un parvovirus o de un anelovirus.

El elemento promotor de la cápsida o un complemento inverso del mismo se puede localizar adyacente al promotor inmediato/temprano de citomegalovirus, o alternativamente se puede localizar hasta 1100 pares de bases por delante (en 5') del promotor inmediato/temprano de citomegalovirus.

La célula hospedadora puede ser una línea celular de mamífero para la expresión del transgén in vitro.

De acuerdo con una segunda realización de la invención, se da a conocer un casete de expresión de mamífero que incluye:

un elemento promotor inmediato/temprano de citomegalovirus (Pcmv) o un elemento promotor del SV40; y

una secuencia del elemento promotor de la cápsida (Pcap) o un complemento inverso (PcapR) de la misma localizada por delante (en 5') del elemento promotor de citomegalovirus o de un elemento promotor del SV40, en donde la secuencia de Pcap o de PcapR es al menos idéntica al 80% a alguna de las secuencias seleccionadas de SEQ ID n.º 1-18, 21, 22 y 24.

Se puede introducir un transgén en el casete de expresión por detrás (en 3') del promotor de CMV.

El casete de expresión puede ser capaz de expresar el transgén en más cantidad que un casete de expresión similar45 que no incluye las secuencias de Pcap ni de PcapR.

El elemento promotor de la cápsida o el complemento inverso del mismo puede ser de un circovirus tal como el circovirus porcino de tipo 1 (PCV-1) , el circovirus porcino de tipo 2 (PCV-2) , el virus del pico y las plumas (BFDV) , el circovirus del canario, el circovirus de los colúmbidos, el circovirus del pato, el circovirus del pinzón, el circovirus del ganso y el circovirus de la gaviota, o un elemento equivalente de un parvovirus tal como el parvovirus canino o un anelovirus tal como el virus torque teno y el minivirus torque teno.

La secuencia de Pcap o PcapR puede ser al menos idéntica al 80%, más preferiblemente idéntica al menos al 90% e incluso más preferiblemente al menos al 95%, e incluso más preferiblemente idéntica al 100%, a alguna de las SEQ ID n.º 1 a 18, 21, 22 o 24.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se da a conocer un vector que incluye el casete de expresión que se 10 describe más arriba.

El vector o casete de expresión se puede introducir en una célula hospedadora, que puede ser una línea celular de mamífero para la expresión in vitro del transgén o una célula de un organismo hospedador de mamífero para la expresión in vivo del transgén.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se da a conocer una célula hospedadora transformada con el vector o 15 el casete de expresión que se describe más arriba.

De acuerdo con otra realización de la invención, se da a conocer una vacuna de ADN que incluye un vector o casete de expresión que se describe más arriba.

De acuerdo con otra realización de la invención, se da a conocer una composición farmacéutica que incluye el vector

o casete de expresión que se describe más arriba.

De acuerdo con otra realización de la invención, se da a conocer el uso de un vector de ADN según se describe más arriba en un procedimiento para la fabricación de un medicamento para ser usado en un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad.

La composición farmacéutica o vacuna de ADN se puede utilizar para el tratamiento terapéutico o preventivo de una enfermedad o infección, tal como el VIH y/o el sida. Así pues, se da a conocer una composición farmacéutica según

se describe en la presente memoria para ser usada en el tratamiento del VIH o del sida.

Breve descripción de los dibujos Figura 1: clonación de las construcciones iniciales del vector que contienen PCV-1 y de las construcciones que contienen Pcap y PcapR:

(a) Descripción del genoma circular nativo del circovirus porcino de tipo 1 (PCV-1) ; genoma linealizado del PCV-1

con el gen de la cápsida, con la adición de los sitios de restricción de Spe I en los extremos; pTHRep (R) grttnC, en donde el genoma linealizado de PCV-1 está clonado inmediatamente delante, en 5', del Pcmv (CMV I/E Pr) ;

(b) Descripción lineal de las regiones relevantes de los plásmidos pTHRepRgrttnC, pTHPcapgrttnC y pTHPcapRgrttnC, que ilustra las posiciones y orientaciones relativas, con respecto a Pcmv y grttnC, que tiene la secuencia clonada de 184 pb que contiene el Pcap.

Figura 2: demostración de que los vectores que contienen PCV-1 no se replican en las células de mamífero: cuantificación por PCR en tiempo real del plásmido digerido con DpnI e intacto extraído de las células 293 de 1 a 3 días posteriores a la transfección (dpt) :

(a) Células 293 transfectadas con pTHgrttnC, pTHRepgrttnC o pTHRepRgrttnC, con o sin la adición del plásmido pcDNARep (expresa las proteínas Rep y Rep' de PCV-1 gracias al Pcmv y es posible que transreplique los ADN

circulares que contienen el origen de replicación de PCV-1, según pTHRepgrttnC y pTHRepRgrttnC) . El ADN se extrajo de las células transfectadas 48 h después de la transfección. Los resultados demuestran que los plásmidos que contienen el PCV-1 ni se replican ni se pueden transreplicar a partir de pcDNARep.

(b) Células 293 transfectadas con pCI y pCIPCV (los plásmidos originales se recibieron de LSBC, y se presupone que son capaces de replicarse) . Los resultados demuestran que al igual que el plásmido parental no replicativo, pCI, 45 el plásmido que contiene el PCV-1, el pCIPCV, no se replica en las células 293.

Figura 3: Demostración de que Prep estimula la expresión desde Pcmv, y que no interviene la replicación del plásmido:

La deleción del intrón del gen rep estimula la expresión a lo largo de pTHgrttnC, a pesar de que se ha perdido la capacidad para hacer que la proteína Rep completa reprima a Prep. La deleción del sitio de fijación de Rep/Rep' en Prep y la mayor parte del gen rep en pTH∆RepgrttnC todavía permite cierta estimulación de la expresión a lo largo de pTHgrttnC, ya que el Prep residual aún codifica todos los sitios de fijación de los factores de transcripción del hospedador en Prep.

Figura 4: demostración de que la incorporación de la secuencia de Pcap o bien de la secuencia de PcapR sola en el 5 pTHgrttnC... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento in vitro para estimular la expresión de un transgén en una célula hospedadora, en donde el procedimiento incluye las etapas de:

(a) inserción de una secuencia de un elemento promotor de la cápsida (Pcap) o un complemento inverso de la misma (PcapR) que es al menos idéntica al 80% a cualquiera de las secuencias seleccionadas de las SEQ ID n.º 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22 y 24 en un casete de expresión de mamífero delante (5') de un promotor inmediato/temprano de citomegalovirus (Pcmv) o un elemento promotor del SV40;

(b) inserción del transgén en el vector por detrás (3') del elemento promotor de citomegalovirus o del elemento 10 promotor del SV40;

(c) inserción del casete de expresión en la célula hospedadora; y

(d) hacer que se exprese el transgén.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se inserta un intrón de citomegalovirus por

detrás (3') del Pcmv y se inserta un sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (poliA de la 15 bgh) por detrás (3') del transgén.

3. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que hace que el transgén se exprese a un nivel más alto que cuando se expresa en un vector que contiene el casete de expresión sin el elemento promotor de la cápsida (Pcap) ni el complemento inverso del mismo.

4. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el elemento promotor de 20 la cápsida o el complemento inverso del mismo es de un circovirus.

5. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la secuencia de Pcap es cualquiera de las secuencias seleccionadas entre SEQ ID n.º 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 21, 24 y 29, o la secuencia de PcapR es cualquiera de las secuencias seleccionadas entre SEQ ID n.º 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 22 y 30.

6. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el elemento promotor de la cápsida o el complemento inverso del mismo se inserta inmediatamente por delante (5') del elemento promotor inmediato/temprano de citomegalovirus o del elemento promotor del SV40.

7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el elemento promotor de la cápsida o el complemento inverso del mismo se inserta hasta 1100 pares de bases por delante (5') del 30 elemento promotor inmediato/temprano de citomegalovirus o del elemento promotor del SV40.

8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula hospedadora es una línea de células de mamífero.

9. Casete de expresión de mamífero, que incluye:

(a) un elemento promotor inmediato/temprano de citomegalovirus (Pcmv) o un elemento promotor del SV40; y

(b) una secuencia del elemento promotor de la cápsida (Pcap) o un complemento inverso (PcapR) de la misma localizada por delante (5') del elemento promotor de CMV o del elemento promotor del SV40, en donde la secuencia de Pcap o la secuencia de PcapR es al menos idéntica al 80% a cualquiera de las secuencias seleccionadas entre SEQ ID n.º 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22 y 24.

10. Casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 9, que incluye un transgén por detrás (3') del 40 elemento promotor inmediato/temprano de citomegalovirus o del elemento promotor del SV40.

11. Vector que incluye un casete de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10.

12. Célula hospedadora transformada con un vector de acuerdo con la reivindicación 11.

13. Vacuna de ADN que incluye un vector o casete de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

14. Composición farmacéutica que incluye un vector o casete de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

15. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14, para ser usada en el tratamiento del VIH o del sida.