Secuencias de serotipo 9 de virus adeno-asociado (AAV), vectores que las contienen, y usos de las mismas.

Un virus adeno-asociado (AAV) recombinante que comprende una cápside de AAV9 que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm.

2 o una secuencia de aminoácido al menos un 95% idéntica con la misma, donde dicho AAV recombinante comprende además un minigén que tiene repeticiones de terminal invertido de AAV y un gen heterólogo enlazado operativamente a secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula anfitrión.

Secuencias de serotipo 9 de virus adeno-asociado (AAV) , vectores que las contienen, y usos de las mismas.

Antecedentes de la invención Un virus adeno-asociado (AAV) , un miembro de la familia Parvovirus, es un pequeño virus icosaédrico, sin envoltura, con genomas de ADN lineales de cadena simple de 4, 7 kilobases (kb) a 6 kb. El AAV se asigna al género Dependovirus, debido a que el virus fue descubierto como contaminante en acumulaciones de adenovirus purificados. El ciclo de vida del AAV incluye una fase latente en la que los genomas de AAV, tras la infección, son el sitio integrado específicamente en cromosomas anfitrión y una fase infecciosa en la que, a continuación de la infección ya sea por adenovirus o ya sea por virus herpes simplex, los genomas integrados son posteriormente rescatados, replicados y empaquetados en virus infecciosos. Las propiedades de no patogenicidad, amplia gama de infectividad de anfitrión, incluyendo las células sin división, y la potencial integración cromosómica específica del sitio, hacen del AAV una atractiva herramienta para transferencia de gen.

Estudios recientes sugieren que los vectores de AAV pueden ser el vehículo preferido para el suministro de gen. Hasta la fecha, han existido 6 serotipos diferentes de AAVs aislados a partir de humanos y de primates no humanos (NHP) , y bien caracterizados. Entre ellos, el serotipo 2 humano es el primer AAV que fue desarrollado como vector de transferencia de gen; Se ha usado ampliamente para experimentos eficientes de transferencia de gen en diferentes tejidos objetivo y modelos animales. Los ensayos clínicos de la aplicación experimental de vectores a base de AAV2 a algunos modelos de enfermedad humana están en curso, e incluyen enfermedades tales como fibrosis quística y hemofilia B.

Lo que resulta deseable son construcciones a base de AAV para suministro de gen.

Sumario de la invención En un aspecto, la invención proporciona secuencias novedosas de AAV, composiciones que contienen esas secuencias, y usos de las mismas. Ventajosamente, esas composiciones son muy adecuadas para su uso en composiciones que requieren la readministración de rAAV con fines terapéuticos o profilácticos.

Estos y otros aspectos de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada que sigue de la invención.

Breve descripción de los dibujos Las Figuras 1A, 1B y 1C son secuencias de ácido nucleico de las regiones rep y cap de AAV9 [SEQ ID Núm. 1].

Las Figuras 2A, 2B y 2C son un alineamiento de las secuencias de aminoácido de la proteína vp1 de la cápside de las nuevas secuencias de AAV9 [SEQ ID Núm. 2] de la invención en comparación con las secuencias publicadas de AAV2 [SEQ ID Núm. 4], AAV1 [SEQ ID Núm. 5], y AAV3 [SEQ ID Núm. 6] y de un nuevo serotipo AAV8 [SEQ ID Núm. 7], que es el objeto de una solicitud en trámite. El alineamiento fue realizado usando el programa Clustal W, con la numeración de AAV usada como referencia. El subrayado y la negrita bajo las secuencias de AAV9 indican casetes de identidad dentro de la HVR.

Las Figuras 3A, 3B y 3C son las secuencias de aminoácido de las proteínas rep de AAV9 [SEQ ID Núm. 3].

Descripción detallada de la invención La invención proporciona las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de un nuevo serotipo de AAV, el AAV9. También se proporcionan fragmentos de esas secuencias de AAV. Cada uno de esos fragmentos puede ser utilizado fácilmente en una diversidad de sistemas de vector y de células anfitrión. Entre los fragmentos de AAV9 deseables están las proteínas cap, incluyendo la vp1, vp2 y vp3. Otros fragmentos de interés incluyen las regiones hipervariables, las proteínas rep, incluyendo la rep78, rep68, rep52 y rep40, y las secuencias que codifican esas proteínas. Esos fragmentos pueden ser utilizados fácilmente en una diversidad de sistemas de vector y de células anfitrión. Tales fragmentos pueden ser usados solos, en combinación con otras secuencias de AAV9 o fragmentos, o en combinación elementos procedentes de AAV viral o de AAV no viral. En una realización particularmente deseable, un vector contiene las secuencias cap y rep de AAV9 de la invención.

Las secuencias de AAV y los fragmentos de las mismas, son útiles en la producción de rAAV, y son también útiles como vectores de suministro antisentido, vectores de terapia de gen, o vectores de vacuna. La invención proporciona además moléculas de ácido nucleico, vectores de suministro de gen, y células anfitrión que contienen las secuencias de AAV9 de la invención.

Los fragmentos adecuados pueden ser determinados usando la información proporcionada en la presente memoria.

Las alineaciones se realizan usando cualquiera de una diversidad de Programas de Alineamiento de Secuencia Múltiple disponibles pública o comercialmente, tal como el “Clustal W”, accesible a través de Servidores Web por Internet. Alternativamente, se usan también utilidades de vector NTI. Existe también un número de algoritmos conocidos en el estado de la técnica que pueden ser usados para medir identidad de secuencia de nucleótido, incluyendo los contenidos en los programas descritos con anterioridad. Según otro ejemplo, las secuencias de polinucleótido pueden ser comparadas usando Fasta, un programa en GCG Versión 6.1. Fasta proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y búsqueda. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico puede ser determinado usando Fasta con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) según se proporciona en GCG Versión 6.1, incorporado en la presente memoria por referencia. Se encuentran disponibles programas similares para secuencias de aminoácido, por ejemplo el programa 2Clustal X”. En general, cualquiera de esos programas se utiliza en configuraciones por defecto, aunque un experto en la materia alterar esas configuraciones según se necesite. Alternativamente, un experto en la materia puede utilizar otro algoritmo o programa de ordenador que proporcione al menos un nivel de identidad o alineamiento como el proporcionado por los algoritmos y programas referenciados.

El término “homología sustancial” o “similitud sustancial”, cuando se refieren a ácido nucleico, o a un fragmento del mismo, indica que cuando se alinea óptimamente con inserciones o supresiones de nucleótido apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria) , existe identidad de secuencia de nucleótido en al menos alrededor de un 95 a un 99% de las secuencias alineadas. Con preferencia, la homología es sobre la secuencia de longitud completa, o sobre una trama de lectura abierta de la misma.

El término “homología sustancial” o “similitud sustancial”, cuando se refiere a aminoácidos o a un fragmento de los mismos, indica que, cuando se alinean óptimamente con inserciones o supresiones de aminoácido apropiadas con otro aminoácido (o su cadena complementaria) , existe identidad de secuencia de aminoácido en al menos alrededor de un 95 a un 99% de las secuencias alineadas. Con preferencia, la homología es sobre la secuencia de longitud completa, o sobre una proteína de la misma, por ejemplo, una proteína cap, o una proteína rep.

Mediante el término “altamente conservado” se entiende al menos una identidad del 80%, con preferencia al menos una identidad del 90%, y más preferentemente, una identidad por encima del 97%. La identidad la determina fácilmente un experto en la materia recurriendo a algoritmos y programas de ordenador conocidos por los expertos en la materia.

El término “porcentaje de identidad de secuencia” o “idéntico” en el contexto de secuencias de ácido nucleico, se refiere a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean respecto a una correspondencia máxima. La longitud de comparación de identidad de secuencia puede ser sobre la longitud completa del genoma, la longitud completa de una secuencia de codificación de gen, o un fragmento de al menos alrededor de 500 a 5000 nucleótidos, si se desea. De forma similar, se puede determinar fácilmente el “porcentaje de identidad de secuencia” para secuencias de aminoácido, sobre la longitud completa de una proteína.

Según se describe en la presente memoria, los vectores de la invención que contienen las proteínas de cápside de AAV de la invención son particularmente adecuados para su uso en aplicaciones en las que los anticuerpos neutralizantes disminuyen la efectividad de otros vectores basados en serotipo de AAV, así... [Seguir leyendo]

1. Un virus adeno-asociado (AAV) recombinante que comprende una cápside de AAV9 que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 2 o una secuencia de aminoácido al menos un 95% idéntica con la misma, donde dicho AAV recombinante comprende además un minigén que tiene repeticiones de terminal invertido de AAV y un gen heterólogo enlazado operativamente a secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula anfitrión.

2. El AAV recombinante según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácido es al menos un 99%

idéntica con los aminoácidos 1 a 736 de SEQ ID Núm. 2. 3. El AAV recombinante según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácido es la de aminoácidos 1 a 736 de SEQ ID Núm. 2.

4. Una proteína aislada que comprende una proteína de cápside de AAV9 seleccionada en el grupo consistente en: proteína de cápside vp1, aminoácidos (aa) 1 a 736; proteína de cápside vp2, aa 138 a 736, y proteína de cápside vp3, aa 203 a 736;

en el que los números de aminoácidos son los de la cápside de AAV9, SEQ ID Núm. 2. 5. Una molécula que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína según la reivindicación

4, en la que dicha secuencia de ácido nucleico se elige en el grupo consistente en: vp1, nt 2116 a 4326; vp2, nt 2527 a 4326, y vp3, nt 2722 a 4326,

en la que los números de nucleótidos son de AAV9, SEQ ID Núm. 1.

6. La molécula según la reivindicación 5, en la que dicha molécula comprende una secuencia de AAV que codifica una proteína de cápside de AAV y una proteína rep funcional de AAV. 7. La molécula según la reivindicación 5 ó 6, en la que dicha secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia

que codifica una proteína rep seleccionada en el grupo consistente en rep 78, rep 68, rep 52 y rep 40.

8. La molécula según la reivindicación 6, en la que la secuencia de AAV que codifica la proteína rep se elige en el grupo consistente en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 y AAV6. 9. La molécula según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en la que dicha molécula es un plásmido. 10. Un método de generación de un virus adeno-asociado (AAV) recombinante que comprende una cápside de

serotipo de AAV, que comprende las etapas de cultivar una célula anfitrión que contiene: (a) una molécula que codifica una proteína de cápside de AAV; (b) un gen rep funcional; (c) un minigén que comprende repeticiones de terminal invertido (ITRs) de AAV y un transgén, y (d) funciones auxiliares suficientes para permitir el empaquetamiento del minigén en la proteína de cápside de AAV, en el que dicha célula anfitrión comprende una molécula según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9.

11. Una célula anfitrión en cultivo transfectada con un virus adeno-asociado según cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 3, o con una molécula según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9. 12. Una composición que comprende un AAV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un portador fisiológicamente compatible.

13. Un virus adeno-asociado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una molécula según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, para su uso en el suministro de un transgén a una célula.