Prueba genética para predisposición genética de hemofilia B en perro crestado rodesiano.

El gen de factor IX canino aislado de acuerdo con la Sec ID N.º: 1 que tiene una mutación puntual, en el que el nucleótido 752 es A en vez de G.

Prueba genética para predisposición genética de hemofilia B en perro crestado rodesiano La invención se refiere a una prueba genética para predisposición genética de hemofilia B en perro crestado rodesiano genotipando el gen del factor IX canino.

Introducción La hemofilia B es una afección que afecta el proceso de coagulación de la sangre por falta de factor de coagulación IX biológicamente activo. El factor IX es una glucoproteína plasmática de 56 kDa que se requiere para activación de Factor X en la cascada de coagulación. La hemofilia canina B representa una coagulopatía hereditaria que se da en la naturaleza con un intervalo de gravedad de signos clínicos y actividad coagulante en diferentes variantes de cría. Se ha informado de casos en muchas razas. En perros crestados rodesianos, una forma grave de hemofilia B con signos clínicos pronunciados se describió por primera vez por Lutze et al. (2000) . Actualmente es la forma de hemofilia canina más importante en Alemania.

Bottema C D K et al.: "Missense mutations and evolutionar y conservation of amino acids: evidence that many of the amino acids in factor IX function as spacer elements", American Journal of Human Genetics, American Society of 15 Human Genetics, Chicago, IL, EE.UU., vol.: 49, nº : 4, 1 de enero de 1991 (1-1-1991) , páginas 820-838, XP009007557, ISSN: 0002-9297. Bottema C D K et al. desvela que en el factor IX humano mutaciones de sentido alterado en residuos específicos en el factor IX (es decir, aquellos conservados en factor IX de ser humano, vaca, perro y ratón pero no en proteasas relacionadas) es seis veces menos probable que causen la enfermedad. La posición 244 del factor IX del perro, corresponde a la posición 207 en factor IX humano y en un residuo G conservado. Dicho 20 documento también se refiere a esta posición en seres humanos como una mutación de sentido alterado comunicada.

GIANNELLI F. et al. "Haemophilia B: Database of point mutations and short additions and deletions-cuarta edición, 1993", Nucleic Acids Research, vol. 21, nº : 13, 1993, páginas 3075-3087, XP002659955, ISSN: 0305-1048. Giannelli F. et al. desvela varias mutaciones de Factor IX humano que causan hemofilia. Una de ellas es una mutación G->A en el nucleótido, dando como resultado un cambio de aminoácidos en la posición 253, G253->E; esto corresponde a la 25 posición 244 en factor IX canino (de perro) , donde se sitúa la misma mutación identificada en la solicitud.

F. Giannelli et al.: "Haemophilia B (sixth edition) : a database of point mutations and short additions and deletions", Nucleic Acids Research, vol. 24, nº : 1, 1 de enero de 1996 (1-1-1996) , páginas 103-118, XP55036054, ISSN: 0305-1048, DOI: 10.1093/nar/24.1.103. F. Giannelli et al. desvela adicionalmente una lista larga de mutaciones en el factor IX humano tres de las cuales están en la posición 207, a saber: G207->R, G207->detención y G207->E.

Se han identificado diferentes mutaciones en el gen que codifica el factor IX en diferentes razas de perro, incluyendo, labrador, lhasa apso, pit bull terrier y airedale terrier dando como resultado los síntomas clínicos típicos para hemofilia B (Evans et al., 1989; Mauser et al., 1996; Brooks et al., 1997; Gu et al., 1999; Tabla 11) . Según el mejor conocimiento del autor, el origen genético de hemofilia B en perros crestados rodesianos es desconocido. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue investigar si un defecto genético podría identificarse como causa subyacente de hemofilia en perros crestados rodesianos. Una prueba genética ayudaría a diagnosticar perros enfermos y a identificar genéticamente perros afectados y portadores.

Es el objeto de la presente invención proporcionar una prueba genética para el análisis de un genotipo de un perro, preferentemente un crestado rodesiano con respecto a la hemofilia B.

Este objetivo se logra por las invenciones según se reivindica en las reivindicaciones independientes. Se describen 40 realizaciones ventajosas en las reivindicaciones dependientes.

El problema se resuelve proporcionando un factor IX de acuerdo con la Sec ID Nº : 1 que tiene una mutación puntual, en la que el nucleótido 752 es A en vez de G.

Se ha encontrado que una única mutación puntual en el factor IX canino conduce a una reducción muy fuerte en la actividad del factor y podría asignarse a hemofilia B en el perro, preferentemente en los perros crestados rodesianos.

En la Sec ID Nº : 1 el nucleótido en la posición 752 está mutado de G a A. Esta mutación da como resultado un intercambio de glicina (GGA) a ácido glutámico (GAA) en la posición 244 en el dominio catalítico del factor XI hemofílico (Sec ID Nº : 3; Sec ID Nº : 2 de tipo silvestre) .

La invención se refiere por lo tanto a una prueba genética para identificación de al menos una mutación puntual en la Sec ID Nº : 1 del genoma del perro, en el que al menos una mutación puntual conduce a un intercambio de 50 aminoácidos en posición 244 de factor canino IX.

La mutación puntual es una mutación puntual en el nucleótido 752 de la Sec ID Nº : 1, en la que el nucleótido 752 es A en vez de G.

El análisis se puede usar también para detectar mutaciones adicionales en la secuencia Sec ID Nº : 1, por ejemplo mutaciones que no están relacionadas con hemofilia B.

En una realización de la invención el procedimiento para el análisis de un genotipo de un perro con respecto a hemofilia B comprende la identificación de una mutación puntual en la Sec ID Nº : 1 del genoma del perro, en el que una mutación puntual es una mutación puntual en la que el nucleótido 752 es A en vez de G.

Mediante esta prueba es posible identificar el genotipo del perro crestado rodesiano con respecto a hemofilia B y especialmente si la perra es una portadora heterocigota de la mutación.

Los procedimientos para detectar una mutación puntual en un genoma se conocen por el experto en la técnica. Los procedimientos posibles son secuenciar la región del genoma, donde la mutación está localizada, con cebadores específicos y comparar después la secuencia con la secuencia de tipo silvestre. La secuenciación se puede hacer

directamente con el ADN genómico o por amplificación de la región seleccionada y después secuenciando la secuencia amplificada.

Otros procedimientos posibles comprenden reacción en cadena de la ligasa (LCR) , polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) , espectroscopía de masas (MALDI-TOF) , SSCP, DGGE, pirosecuenciación, dHPLC, hibridación de alelos específicos, balizas moleculares, micromatrices, endonucleasa Flap (FEN) , PCR en tiempo real,

PCR específica de alelos, ensayo de Taqman.

Por ejemplo se puede usar PCR para la amplificación de la región de la mutación puntual, la región de Sec ID Nº : 1, que contiene al menos un de las mutaciones puntuales en la Sec ID Nº : 1 del genoma del perro, en la que el nucleótido 752 es A en vez de G.

En una realización preferida el perro es un crestado rodesiano.

Otra realización de la invención es un procedimiento para la determinación de la predisposición genética para hemofilia B de un perro mediante el uso del gen del factor IX canino del perro de acuerdo con la Sec ID Nº : 1 que tiene al menos una mutación puntual en la Sec ID Nº : 1 del genoma del perro, en la que al menos una mutación puntual conduce a un intercambio de aminoácidos en posición 244 del factor IX canino.

La mutación puntual es una mutación puntual en el nucleótido 752, en la que este nucleótido es A en vez de G.

En una realización preferida el perro es un crestado rodesiano.

En otra realización de la invención este procedimiento se pueden usar para la selección de un perro crestado rodesiano para cría.

Incluso si no se recogen referencias de apoyo múltiples, se desvelarán en las reivindicaciones todas las combinaciones razonables de las características.

Tabla 1. Supervivencia en la bibliografía de mutaciones en gen del factor IX canino en perros con hemofilia;

Tabla 2. Resultados de análisis de secuencia del ADN del factor IX canino y ensayo de genotipado TaqMan para una mutación G-A de sentido alterado en el exón 7 en perros crestados rodesianos con estátus de hemofilia B diferente (Señalamiento, linaje: Portadora confirmada, madres de los números 4 y 5; signos clínicos: Sangrado grave después de intervenciones quirúrgicas menores; Análisis de secuencia: n = normal c = portadora a = afectado) y daños,

sangrado espontáneo ocasional (+/-) ) ;

Fig. 1. Alineamiento de secuencia aminoacídico de dominio proteasa de factor IX canino (CFIX) con factor IX humano... [Seguir leyendo]

1. El gen de factor IX canino aislado de acuerdo con la Sec ID Nº : 1 que tiene una mutación puntual, en el que el nucleótido 752 es A en vez de G.

2. Procedimiento de análisis de un genotipo de un perro con respecto de hemofilia B por un ensayo genético para

identificación de al menos una mutación puntual en la Sec ID Nº : 1 del genoma del perro, en el que al menos una mutación puntual conduce a un intercambio aminoacídico en la posición 244 de factor IX canino, en el que una mutación puntual es una mutación puntual en nucleótido 752 y en el que la mutación puntual en nucleótido 752 es una mutación puntual, donde el nucleótido 752 es A en vez de G y en el que al menos esta mutación puntual define el genotipo del perro con respecto a hemofilia B.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la PCR se usa para amplificación de una región de Sec ID Nº : 1, que contiene la mutación puntual del nucleótido 752.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 o 3, en el que el perro es un crestado rodesiano.

5. Procedimiento para la determinación de la predisposición genética para hemofilia B de un perro, caracterizado por el uso del gen del factor IX canino del perro de acuerdo con la Sec ID Nº : 1 que tiene una mutación puntual en Sec

ID Nº : 1 del genoma del perro, en la que al menos una mutación puntual conduce a un intercambio aminoacídico en la posición 244 del factor XI canino y en la que una mutación en un punto es una mutación puntual, en la que el nucleótido 752 es A en vez de G y en la que al menos esta mutación puntual determina la predisposición genética para hemofilia B del perro.

6. Uso del procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 para la selección de un perro crestado rodesiano para 20 reproducción.