Proteína de fusión de melusina recombinante como agente farmacológico en el tratamiento de patologías cardiacas y composiciones de la misma.

Una proteína de fusión de melusina recombinante que tiene in vivo una estabilidad mejorada y una capacidad para alcanzar compartimentos intracelulares en comparación con la melusina recombinante codificada por la secuencia de nucleótidos como se define en SEC ID Nº:

1, en donde dicha proteína de fusión de melusina recombinante comprende

i) una proteína melusina seleccionada de

a) una proteína melusina humana que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos como se define en SEC ID Nº: 1,

b) un homólogo de la misma que tiene al menos un 60 %, preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos como se define en SEC ID Nº: 1 y que tiene la función de inducción de hipertrofia cardiaca de la proteína melusina nativa,

c) una parte de melusina humana de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos como se define en SEC ID Nº: 1 que tiene la función de inducción de hipertrofia cardiaca de la proteína melusina nativa

y ii) un polipéptido que penetra en células en donde dicho polipéptido que penetra en células se selecciona entre: polipéptido Tat de VIH, polilisina, péptidos del homeodominio de antennapedia, las secuencias expuestas en SEC ID Nº: 11 a 20.

Proteína de fusión de melusina recombinante como agente farmacológico en el tratamiento de patologías cardiacas y composiciones de la misma

Campo de la invención La presente invención se refiere a una forma recombinante de la proteína humana melusina o partes de la misma para el tratamiento de patologías cardiacas, tales como insuficiencia cardiaca, cardiomiopatía dilatada e infarto de miocardio.

Antecedentes de la invención En sujetos aquejados de patologías cardiovasculares tales como estenosis aórtica, hipertensión arterial crónica, disfunción valvular, infarto de miocardio, miocarditis, cardiomiopatía idiopática, el corazón se somete a mayor carga de trabajo. La presencia de una lesión patológica induce que el corazón experimente hipertrofia, un programa de remodelación tisular dirigido a mantener la función cardiaca. Aunque la hipertrofia cardiaca es, por lo tanto, inicialmente compensatoria y beneficiosa, en condiciones de estímulos patológicos crónicos, pueden producirse acontecimientos adicionales que reducen la eficacia de la respuesta de hipertrofia o activan rutas adicionales que provocan dilatación cardiaca y que conducen progresivamente a disfunción e insuficiencia cardiaca.

Las propiedades funcionales de la melusina pueden proporcionar un enfoque altamente innovador y robusto para contrarrestar la evolución hacia la disfunción e insuficiencia cardiacas.

La melusina, de hecho, se expresa selectivamente en fibras de músculo esquelético y cardiomiocitos (Brancaccio et al., 1999) , y se requiere para activar un programa de hipertrofia cardiaca compensatoria en respuesta a condiciones de tensión tales como sobrecarga de presión crónica del ventrículo izquierdo (Brancaccio et al., 2003) . Dicha función requiere la activación de AKT/GSK3beta y de ERK (Brancaccio et al., 2003) (De Acetis et al., 2005) , dos rutas de señalización bien conocidas en la hipertrofia cardiaca.

La expresión forzada de melusina en el corazón de ratones transgénicos protege eficazmente de la dilatación del ventrículo izquierdo e insuficiencia cuando el corazón se somete a sobrecarga de presión prolongada (De Acetis et al., 2005) .

En pacientes humanos aquejados de cardiomiopatía dilatada en respuesta a reducción de estenosis aórtica la expresión de melusina es comparable al deterioro cardiaco funcional como se mide por valores de fracción de eyección (Brokat et al 2007) .

El documento EP-A-1 800 696 desvela una proteína de fusión que comprende la proteína de unión a maltosa y melusina humana.

Las medicaciones principales actuales para el tratamiento de Insuficiencia Cardiaca (CHF) incluyen fármacos dirigidos a la sobrecarga hemodinámica (diuréticos y nitratos) , para inhibir la actividad tanto de renina-angiotensina (inhibidores de ACE y sartanos) como del sistema nervioso simpático (beta bloqueadores) . Aunque el desarrollo de estos fármacos ha conducido a un mejor tratamiento, el 50 % de los pacientes con el estadio más avanzado de insuficiencia cardiaca mueren en un periodo de un año, siendo el trasplante de corazón aún la única cura. De hecho, la mayoría de, si no todos, los fármacos disponibles se dirigen principalmente a reducir la sobrecarga hemodinámica cardiaca reduciendo la presión sanguínea y consecuencias indeseables de la insuficiencia cardiaca en diferentes órganos periféricos.

Por lo tanto, los enfoques terapéuticos dirigidos a corregir los defectos principales en el músculo cardiaco que forman la base de la insuficiencia cardiaca representan una necesidad médica actual importante ya que deberían proporcionar un resultado mucho más eficaz en comparación con la terapia inotrópica o dispositivos mecánicos que asistan a la función cardiaca.

Sumario de la invención Teniendo en cuenta estas premisas, se siente por lo tanto una necesidad de soluciones mejoradas que permitan el tratamiento terapéutico de patologías cardiacas, tales como insuficiencia cardiaca, y cardiomiopatía provocada por estenosis aórtica, hipertensión arterial crónica, disfunción valvular, infarto de miocardio, miocarditis o cardiomiopatía idiopática, evitando las desventajas a las que se ha hecho referencia anteriormente.

El objetivo de la presente divulgación es proporcionar dichas soluciones mejoradas.

De acuerdo con la invención, el objetivo anterior se consigue gracias a la materia objeto reivindicada específicamente en las reivindicaciones posteriores, que se entiende que forma una parte integral de la presente divulgación. Una realización de la presente divulgación proporciona una proteína de fusión de melusina recombinante que tiene una estabilidad mejorada y una capacidad potenciada para alcanzar los compartimentos intracelulares en comparación con la melusina recombinante codificada por la secuencia de nucleótidos como se define en SEC ID

Nº: 1 in vivo, en la que dicha proteína de fusión de melusina recombinante comprende i) una proteína melusina humana que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos como se define en SEC ID Nº:1, o un homólogo de la misma que tiene al menos 60 %, presentemente al menos 80 %, más preferentemente al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos como se define en SEC ID Nº: 1 y que tiene la función de inducción de hipertrofia cardiaca de proteína melusina nativa o una parte de melusina humana de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos como se define en SEC ID Nº: 1 que tiene la función de inducción de hipertrofia cardiaca de la proteína melusina nativa y ii) un polipéptido que penetra en células seleccionado entre polipéptido TAT de VIH, polilisina, péptidos del homeodominio de antennapedia, péptidos de las secuencias 11-20 (Figura 6) .

En una realización adicional, la proteína de fusión de melusina recombinante puede conjugarse por el extremo N terminal con una secuencia marcadora, que puede seleccionarse entre proteína de unión a maltosa (MBP) , glutatión S-transferasa (GST) , péptidos de hexahistidina (HIS) , epítopo Flag, epítopo Myc, dominio Ig, proteína estafilocócica A.

En una realización adicional más divulgada en la presente solicitud, la proteína de fusión de melusina recombinante puede usarse como un medicamento, preferentemente para el tratamiento de patologías cardiacas, más preferentemente insuficiencia cardiaca y cardiomiopatía provocadas por estenosis aórtica, hipertensión arterial crónica, disfunción valvular, infarto de miocardio, miocarditis o cardiomiopatía idiopática.

La proteína de fusión de melusina recombinante objeto de la presente divulgación tiene actividad de inducción de hipertrofia cardiaca in vivo.

Breve descripción de los dibujos La invención se describirá ahora, solamente como ejemplo, con referencia a las figuras dibujadas adjuntas, en las que:

-Figura 1: secuencias de nucleótidos y aminoácidos de (A) MBP-TAT-melusina y (B) MBP-melusina-TAT. La secuencia de aminoácidos de MBP está subrayada, la secuencia de TAT está en negrita, la secuencia de

aminoácidos de melusina tiene doble subrayado, el sitio de escisión de proteasa de TEV está indicado por una línea de puntos. (C) Representación esquemática de la estrategia de clonación usada para insertar secuencias codificantes de melusina, TAT y TEV en vectores pMAL. (D) Tinciones de Coomassie de extractos proteicos totales de E. coli que producen proteínas de fusión MBP-melusina-TAT (izquierda) y MBP-TAT-melusina (derecha) ; flujo continuo después de la purificación de proteínas y fracción de elución que contiene las proteínas purificadas. (E) Cromatograma de HPLC de MBP-melusina-TAT eluida de una columna de intercambio de iones Resource Q (GE HelthCare) con un gradiente de Tris-HCl 25 mM pH 7, 5 a Tris-HCl 25 mM pH 7, 5 más NaCl 1 M. La proteína eluye a NaCl 140 mM.

-Figura 2. (A) Capacidad de la proteína MBP Melusina recombinante para entrar en células eucariotas. Se incubaron células COS cultivadas en placas de petri con 50 !g/ml de MBP-melusina-TAT recombinante, MBP45 TAT-melusina o MBP-melusina durante 2 horas. Después de lavados repetidos con PBS, las células se fijaron con detergente. Después se visualizó la melusina por inmunofluorescencia con microscopía confocal usando anticuerpos monoclonales de ratón 5E1 para melusina humana (MAB-10333 Immunological Science www.immunologicalsciences.com) seguido de inmunoglobulina secundaria anti ratón marcada con RITC. Se tomaron imágenes con microscopia confocal a tiempo de exposición fijo en planos focales dentro del citoplasma como se puede visualizar por la presencia de núcleos teñidos con el colorante... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión de melusina recombinante que tiene in vivo una estabilidad mejorada y una capacidad para alcanzar compartimentos intracelulares en comparación con la melusina recombinante codificada por la secuencia de nucleótidos como se define en SEC ID Nº: 1, en donde dicha proteína de fusión de melusina recombinante comprende i) una proteína melusina seleccionada de a) una proteína melusina humana que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos como se define en SEC ID Nº: 1, b) un homólogo de la misma que tiene al menos un 60 %, preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos como se define en SEC ID Nº: 1 y que tiene la función de inducción de hipertrofia cardiaca de la proteína melusina nativa, c) una parte de melusina humana de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos como se define en SEC ID Nº: 1 que tiene la función de inducción de hipertrofia cardiaca de la proteína melusina nativa y ii) un polipéptido que penetra en células en donde dicho polipéptido que penetra en células se selecciona entre: polipéptido Tat de VIH, polilisina, péptidos del homeodominio de antennapedia, las secuencias expuestas en SEC ID Nº: 11 a 20.

2. La proteína de fusión de melusina recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido 25 que penetra en células se conjuga con el extremo C terminal de dicha proteína melusina o parte de la misma.

3. La proteína de fusión de melusina recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha proteína melusina o parte de la misma se conjuga por el extremo N terminal con una secuencia marcadora.

4. La proteína de fusión de melusina recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicha secuencia marcadora se selecciona entre proteína de unión a maltosa (MBP) , glutatión S-transferasa (GST) , péptido de hexahistidina (HIS) , epítopo Flag, epítopo Myc, dominio Ig, proteína estafilocócica A.

5. La proteína de fusión de melusina recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso como un medicamento.

6. La proteína de fusión de melusina recombinante de acuerdo con la reivindicación 5 para uso en el tratamiento de patologías cardiacas, preferentemente insuficiencia cardiaca y cardiomiopatía. 40

7. La proteína de fusión de melusina recombinante de acuerdo con la reivindicación 5 para uso en la prevención de insuficiencia cardiaca y cardiomiopatía por inducción de hipertrofia cardiaca.

8. La proteína de fusión de melusina recombinante de acuerdo con la reivindicación 5 para uso en la prevención de 45 insuficiencia cardiaca.

9. La proteína de fusión de melusina recombinante de acuerdo con la reivindicación 5 para uso en la prevención de insuficiencia cardiaca en un sujeto que padece sobrecarga de presión.

10. La proteína de fusión de melusina recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en donde dicha proteína de fusión de melusina recombinante es adecuada para administración parenteral.

11. Construcción de ADN que codifica la proteína de fusión de melusina recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.