Proteína de fusión anticoagulante anclada a membrana de la célula.

Un animal no humano que comprende un tejido biológico, en el que el tejido comprende una célula,

la célula expresa una o más proteínas que comprenden una región con actividad anticoagulante y una región que puede anclar dicha proteína a una membrana celular, en la que la región de anclaje y la región anticoagulante de la proteína derivan de proteínas diferentes, y en la que la región anticoagulante comprende la secuencia de un polipéptido anticoagulante seleccionado entre los grupos que consisten en:

i) hirudina, inhibidor de la vía del factor tisular, péptido anticoagulante de la garrapata y un activador de la proteína C;

ii) derivados y fragmentos funcionales de i) que retienen la actividad anticoagulante;

iii) heparina y antitrombina;

iv) derivados y fragmentos funcionales de iii) que retienen la actividad anticoagulante; y

v) derivados anticoagulantes de la trombina.

Proteína de fusión anticoagulante anclada a membrana de la célula.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a la inhibición de la coagulación sanguínea, especialmente durante el rechazo de

órganos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La técnica quirúrgica del trasplante de órganos ha sido ahora practicada con éxito durante varias décadas y, debido a su éxito, el procedimiento se ha extendido y se podría mantener que se ha convertido en rutinario. Sin embargo, el suministro de órganos adecuados para trasplante no es capaz de satisfacer las demandas siempre en aumento.

Debido a la escasez de órganos humanos adecuados (esto es, alogénicos), la posibilidad de utilizar órganos de animales (esto es, xenogénicos) en las operaciones de trasplante en humanos ("xenoinjerto" o "xenotras- plante") ha estado recibiendo cada vez más atención en los años recientes (por ejemplo, Nature 1997; 385: 285). Se cree que los órganos donantes de porcino son candidatos adecuados, ya que los cerdos son anatómicamente y fisiológicamente similares a los humanos y hay un suministro abundante.

La realización de xenoinjertos está actualmente impedida, sin embargo, por los graves y bien documentados problemas de rechazo. Este proceso puede ser dividido en etapas distintas, la primera de las cuales tiene lugar a los minutos del trasplante. Ésta es conocida como respuesta hiperaguda y está causada por anticuerpos existentes en el receptor que reconocen y reaccionan con antígenos foráneos que están en las células endoteliales (CEs) del xenoinjerto. Este reconocimiento desencadena la cascada del complemento que a su vez da lugar a la lisis y muerte de las CEs del trasplante.

Este rechazo hiperagudo inicial es posteriormente reforzado por la respuesta vascular retardada (conocida también como rechazo vascular agudo o rechazo retardado del xenoinjerto). La lisis y la muerte de las CEs durante la respuesta hiperaguda está acompañada por edema y por la exposición de las células adventicias que expresan constitutivamente en su superficie el factor tisular (TF). Se cree que el factor tisular es fundamental para el inicio de la cascada de coagulación in vivo, y su exposición al plasma desencadena las reacciones de coagulación. La trombina y el TNF-a se localizan alrededor del tejido dañado y esto induce la síntesis y la expresión posterior de TF por las CEs.

El entorno alrededor de las CEs en reposo no favorece la coagulación. Varios inhibidores naturales de la coagulación están asociados con los proteoglicanos extracelulares de las CEs, tales como el inhibidor de la ruta del factor tisular, antitrombina III y trombomodulina. Sin embargo, el reconocimiento del tejido foráneo por anticuerpos naturales xenorreactivos (XNAs), produce la pérdida de estas moléculas. Junto con la exposición y la inducción del factor tisular, el entorno anticoagulante alrededor de las CEs se convierte así en procoagulante.

Las regiones vascularizadas del xenoinjerto se convierten por tanto en lugares de coágulos sanguíneos, una característica del tejido dañado. El flujo sanguíneo disminuye y el órgano trasplantado resulta isquémico. Una descripción más completa del rechazo vascular retardado puede ser encontrada en Bach y col., (1996).

La utilización de órganos xenogénicos en trasplantes está por tanto impedida por un rechazo hiperagudo inicial seguido por un rechazo vascular prolongado, seguido posiblemente por un rechazo mediado por células T. La inhibición de los mecanismos responsables de estos rechazos podría facilitar la utilización de xenoinjertos.

La simple administración de inhibidores adecuados no es, sin embargo, un abordaje particularmente adecuado. La inhibición completa del complemento en un animal receptor es equivalente a inmunosupresión, dejando al sujeto susceptible a infecciones oportunistas. De manera similar, la inhibición de la cascada de la coagulación en un receptor dejará al animal susceptible a un sangrado post-operatorio incontrolado. Por tanto, los inhibidores deberían estar localizados deseablemente en el receptor en el lugar del xenoinjerto.

La prevención del rechazo hiperagudo es el tema de la Patente Europea 0495852 (Imutran). Con el fin de hacer que los tejidos sean más adecuados para un xenoinjerto, esta patente describe que deberían estar asociados con factores homólogos de restricción del complemento, que impiden la activación completa del complemento en el receptor del órgano xenogénico.

Este abordaje ha sido desarrollado y aplicado para producir animales transgénicos con órganos diseñados para sobrevivir al rechazo hiperagudo (Squinto, 1996). Se han producido ratones transgénicos que expresan CD59 humano, un regulador del complemento, en CEs cardíacas (Diamond, 1995). El CD59 humano conservaba la

actividad biológica y el complemento fue inhibido cuando los corazones transgénicos fueron perfundidos con plasma humano.

Se han descrito cerdos transgénicos que expresan DAF humano y/o CD59 humano (McCurry, 1996). El rechazo cardiaco tardó el doble de tiempo en ocurrir en los xenoinjertos transgénicos que en los controles.

La inhibición del rechazo vascular retardado no ha recibido la misma atención, aunque inhibidores de la cascada de coagulación son bien conocidos en la técnica y muchos de ellos han sido bien caracterizados.

Por ejemplo, se sabe que el inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) inhibe la función del complejo activo que se forma normalmente entre el factor tisular, el Factor Vlla y el Factor Xa. El TFPI es un polipéptido soluble de 276 residuos cuyo extremo C cargado positivamente se une al sulfato de heparina en la capa de proteoglicanos de las CEs. Ha sido dividido teóricamente en tres dominios "Kunitz": el Dominio Kunitz I es responsable de la unión al factor tisular y al Factor Vlla; el Dominio II se une al Factor Xa; pero las funciones del Dominio III están menos claras (Hamamoto, 1993).

El péptido anticoagulante de la garrapata (TAP) es un inhibidor específico y potente del Factor Xa. Este polipéptido de 60 aminoácidos ha sido purificado de la garrapata blanda Ornithodoros moubata.

Muchos venenos de serpiente contienen también polipéptidos anticoagulantes. Por ejemplo, un activador de la proteína C de 231 aminoácidos ha sido purificado del veneno de la serpiente Agkistrodon contortrix (McMullen, 1989; Kisiel, 1987).

La hirudina es la proteína anticoagulante utilizada por la sanguijuela Hirudo medicinalis cuando extrae la sangre de su víctima. Es muy potente y se une a la trombina en una proporción 1:1, con una constante de disociación en el rango de femtomolar. El sitio activo de la trombina está enmascarado en el complejo estable y por tanto la hirudina impide la degradación del fibrinógeno, inhibiendo de este modo la formación del coágulo.

Un abordaje posible para localizar anticoagulantes para el lugar del rechazo es ligar hirudina a anticuerpos contra la E-selectina, que se expresa en la superficie de las CEs durante la activación celular. Este abordaje ha demostrado ser eficaz para inhibir la formación del coágulo in vitro (Kiely, 1995). Otras posibles estrategias fueron revisadas recientemente por Bach y col. (1996).

La P-selectina (conocida también como CD62) es expresada también en la superficie de las CEs durante la activación celular. Durante la síntesis es dirigida hacia los gránulos de almacenamiento secretores de las plaquetas y de las células endoteliales por secuencias que residen en su dominio citoplásmico (Disdier, 1992). En respuesta a agonistas celulares, tales como trombina, los gránulos son redistribuidos rápidamente y la P-selectina se expresa en la superficie celular (Green, 1994).

Es un objeto de la presente invención proporcionar proteínas anticoagulantes unidas a membranas. Estas proteínas son adecuadas para inhibir la cascada de coagulación en la superficie de las CEs, inhibiendo de este modo los mecanismos in vivo responsables del rechazo de órganos.

Es un objeto más proporcionar la expresión regulada de tales moléculas en la superficie de las CEs, de tal manera que la inhibición de la coagulación tenga lugar localmente durante las condiciones del rechazo del órgano. El rechazo podría serxenogénico o alogénico.

Es un objeto todavía más de la invención proporcionar tejido biológico adecuado para trasplantes, particularmente para xenotrasplantes.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un animal no humano que comprende un tejido biológico, en el que el tejido comprende una célula, la célula expresa una o más proteínas que comprenden una región con actividad anticoagulante y una región que puede anclar dicha proteína... [Seguir leyendo]

1. Un animal no humano que comprende un tejido biológico, en el que el tejido comprende una célula, la 5 célula expresa una o más proteínas que comprenden una región con actividad anticoagulante y una región que puede anclar dicha proteína a una membrana celular, en la que la región de anclaje y la región anticoagulante de la proteína derivan de proteínas diferentes, y en la que la región anticoagulante comprende la secuencia de un polipéptido anticoagulante seleccionado entre los grupos que consisten en:

i) hirudina, inhibidor de la vía del factor tisular, péptido anticoagulante de la garrapata y un activador de la proteína C;

ii) derivados y fragmentos funcionales de i) que retienen la actividad anticoagulante;

iii) heparina y antitrombina;

iv) derivados y fragmentos funcionales de iii) que retienen la actividad anticoagulante; y 15

v) derivados anticoagulantes de la trombina.

2. El animal no humano de la reivindicación 1, en el que la región anticoagulante comprende la secuencia de una hirudina, un inhibidor de la vía del factor tisular, un péptido anticoagulante de la garrapata, o un activador de la proteína C. 20

3. El animal no humano de la reivindicación 2, en el que la región anticoagulante comprende la secuencia de un inhibidor de la vía del factor tisular.

4. El animal no humano de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la región de anclaje 25 comprende la secuencia transmembranal de una proteína de membrana.

5. El animal no humano de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tejido es una colección de células.

6. El animal no humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el tejido es fibroblastos, una córnea, tejido nervioso, un corazón, un hígado o un riñón.

7. El animal no humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el tejido es un órgano.

8. El animal no humano de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el animal no humano es un animal transgénico.

9. El animal no humano según la reivindicación 8, en el que dicho animal es un cerdo transgénico o una oveja transgénica. 40

10. Un órgano del animal transgénico no humano de las reivindicaciones 8 o 9, en el que dicho órgano comprende una célula, la célula expresa una o más proteínas que comprenden una región con actividad anticoagulante y una región que puede anclar dicha proteína a una membrana celular, en la que la región de anclaje y la región anticoagulante de la proteína derivan de proteínas diferentes, y en la que la región 45 anticoagulante comprende la secuencia de un polipéptido anticoagulante seleccionado entre los grupos que consisten en:

i) hirudina, inhibidor de la vía del factor tisular, péptido anticoagulante de la garrapata y un activador de la proteína C; 50

ii) derivados y fragmentos funcionales de i) que retienen la actividad anticoagulante;

iii) heparina y antitrombina;

iv) derivados y fragmentos funcionales de iii) que retienen la actividad anticoagulante; y

v) derivados anticoagulantes de la trombina.

11. Un tejido biológico que comprende una célula, en el que la célula expresa una o más proteínas que comprenden una región con actividad anticoagulante y una región que puede anclar dicha proteína a una membrana celular, en la que la región de anclaje y la región anticoagulante de la proteína derivan de proteínas diferentes, y en la que la región anticoagulante comprende la secuencia de un polipéptido anticoagulante seleccionado entre los grupos que consisten en: 60

i) hirudina, inhibidor de la vía del factor tisular, péptido anticoagulante de la garrapata y un activador de la proteína C;

ii) derivados y fragmentos funcionales de i) que retienen la actividad anticoagulante;

iii) heparina y antitrombina; 65

iv) derivados y fragmentos funcionales de iii) que retienen la actividad anticoagulante; y

v) derivados anticoagulantes de la trombina.

en el que la célula no se produce utilizando un método que implica la modificación de la identidad genética de la línea germinal del ser humano o que implica el uso de un embrión humano para fines industriales o comerciales.

12. El tejido de la reivindicación 11, en el que el tejido es una colección de células.

13. El tejido de la reivindicación 11, en el que el tejido es un órgano.

14. Un método para hacer que un tejido u órgano sea adecuado para transplante, que comprende la expresión 10 de una proteína en la superficie de las células endoteliales de dicho tejido u órgano, en el que el método no implica la modificación de la identidad genética de la línea germinal del ser humano o uso de un embrión humano para fines industriales o comerciales, y en el que dicha proteína comprende una región con actividad anticoagulante y una región que puede anclar dicha proteína a una membrana celular, en la que la región de anclaje y la región anticoagulante de la proteína se derivan de proteínas diferentes, y en la que la 15 región anticoagulante comprende la secuencia de un polipéptido anticoagulante seleccionado entre los grupos que consisten en:

i) hirudina, inhibidor de la vía del factor tisular, péptido anticoagulante de la garrapata y un activador de la proteína C; 20

ii) derivados y fragmentos funcionales de i) que retienen la actividad anticoagulante;

iii) heparina y antitrombina;

iv) derivados y fragmentos funcionales de iii) que retienen la actividad anticoagulante; y

v) derivados anticoagulantes de la trombina.

15. Un animal no humano según la reivindicación 3, en el que la secuencia de un inhibidor de la vía del factor tisular comprende dominios Kunitz I y II del inhibidor de la vía del factor tisular.