Receptor de células T específico para el antígeno tumoral de Wilms.

Una molécula de receptor de células T (RCT) que contiene una parte de cadena alfa y una parte de cadena beta,

en la que la parte de cadena alfa contiene tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR):

CDR1α: SSYSPS;

CDR2α: YTSAATL; y

CDR3α: WSPFSGGGADGLT o SPFSGGGADGLT,

en la que la parte de cadena beta contiene tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR):

CDR1β: DFQATT;

CDR2β: SNEGSKA; y

CDR3β: SARDGGEG o RDGGEGSETQY, y

en la que en una o más de las CDR se reemplazan hasta tres restos de aminoácidos con otro resto de aminoácido, cuya molécula de RCT puede unirse a un complejo HLA-A2/RFMPNAPYL.

Receptor de células T específico para el antígeno tumoral de Wilms La presente invención se refiere a moléculas terapéuticamente útiles, en particular a receptores de células T (RCT) que pueden introducirse en células T del propio paciente con el fin de conducir a las células T a eliminar las células cancerosas del paciente, particularmente células cancerosas que expresan el antígeno tumoral de Wilms 1 (WT1) .

El listado o análisis de un documento publicado anteriormente en esta memoria descriptiva no debe considerarse necesariamente como un reconocimiento de que el documento es parte del estado de la técnica o es un conocimiento común general. Todos los documentos mencionados en esta memoria descriptiva se incorporan por la presente mediante referencia.

Existen pruebas de que los linfocitos T citotóxicos (LTC) antitumorales juegan un papel importante in vivo. Se ha mostrado que los LTC reactivos frente a tumores intervienen en la regresión tumoral en modelos animales (Kast et al (1989) Cell 59, 603-614) y en seres humanos (Kawakami et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91: 6458-6462; (2002) Science 298: 850-854) . Al igual que con todos los tipos de terapia antitumoral, un problema que ha de superarse es que la terapia debe destruir o inactivar a las células tumorales hasta un grado útil pero que la terapia no debe destruir o inactivar a células no tumorales hasta un grado perjudicial. En otras palabras, es deseable que la terapia sea selectiva para células tumorales a un grado beneficioso.

Gran parte del trabajo actual en inmunoterapia del cáncer se basa en que determinados tumores expresan polipéptidos que no se expresan en el tejido no tumoral equivalente o se basan en que el tumor expresa una forma mutante de un polipéptido que no se expresa en el tejido no tumoral. Sin embargo, no siempre es posible identificar polipéptidos en un tumor que entren dentro de esta categoría, y por ello se han identificado otros polipéptidos diana que pueden formar la base de un enfoque inmunoterapéutico.

En adultos, la expresión del WT1, un factor de transcripción embrionario, se ha observado en podocitos renales, en el testículo, en el ovario, en células mioepiteliales de mama y en algunas células madre CD34+ de la médula ósea. La expresión aberrante se observó en cáncer de mama, cáncer de ovario, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma, sarcoma y leucemia incluyendo LMC y LMA (véase, por ejemplo, Menssen et al (1995) Leukaemia 9, 1060-1067; Inoue et al (1997) Blood 89, 1405-1412; Inoue et al (1996) Blood 88, 2267-2278; Inoue et al (1998) Blood 91, 2969-2976; Menssen et al (1997) Leukaemia 70, 518523; Menssen et al (1995) Leukaemia 9, 1060-1067; Ogawa et al (1998) Transplant 21, 527-527; Rodeck et al (1994) Int. J. Cancer 59, 78-82; Silberstein et al (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 94: 8132-8137; Inoue et al (1996) Blood 88, 4396-4398; Viel et al (1994) Int. J. Cancer 57, 515-521; Menssen (2000) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 126, 226232; Miyoshi (2002) Clin. Cancer Res. 8, 1167-1171; Oji (1999) Jpn J. Cancer Res. 90, 194-204; Oji (2003) Cancer Sci. 94, 523-529; Oji et al (2003) Cancer Sci. 94, 606-611; Oji et al (2003) Cancer Sci. 94, 712-717; y Ueda (2003) Cancel Sci. 94, 271-276.

Como se describe en la solicitud de patente WO00/26249, usando un enfoque no convencional que emplea LTC alogénicos restringidos al MHC, se identificaron epítopos peptídicos en el polipéptido WT1 que deben presentarse mediante moléculas de HLA-A2 de clase I y mostrarse en la superficie de células tumorales que expresan estas proteínas endógenamente. Como fuente de LTC específicos para péptidos presentados mediante moléculas de HLA-A2 de clase I se usaron individuos respondedores HLA-A2 negativos, y este enfoque permitió la identificación de péptidos independientes de posible tolerancia de LTC autólogos presentados mediante HLA-A2.

Uno de los epítopos peptídicos divulgado en el documento WO00/26249 es RMFPNAPYL (que también se ha denominado pWT126) , y anteriormente se ha descrito un LTC que puede: destruir dianas HLA-A2 positivas recubiertas con el péptido pWT126, derivado de WT1 (Gao et al (2000) Blood 95, 2198-2203) ; destruir células de leucemia recientes HLA-A2 positivas que expresan WT1 (Gao et al (2000) Blood 95, 2198-2203) ; destruir células progenitoras de UFC de leucemia HLA-A2 positivas (Gao et al (2000) Blood 95, 2198-2203; Bellantuono et al (2002) Blood 100, 3835-3837) ; destruir células madre de leucemia LTC-IC (del inglés long term culture initiating cells) HLA-A2 positivas (Gao et al (2002) Blood 100, 3835-3837) ; destruir células iniciadoras de leucemia NOD/SCID HLA-A2 positivas (Gao et al (2003) Blood 75, 1429-1436) ; y no destruir células madre hematopoyéticas normales de injertos NOD/SCID HLA-A2 positivas (Gao et al (2003) Transplantation 75, 1429-1436) . Sin embargo, ninguna de estas publicaciones proporciona información molecular concerniente al RCT presente en el LTC, y la línea particular de LTC mencionada en las publicaciones no se ha puesto a disposición del público de ningún modo y por tanto la estructura del RCT se desconoce y el experto no podría obtenerla (ya que la línea de LTC no está disponible al público) .

Los presentes inventores han clonado ahora un RCT que es específico para RMFPNAPYL, un péptido de WT1 que se presenta mediante moléculas HLA-A2 de clase I, y han mostrado que la introducción del RCT en células T CD4 positivas o CD8 positivas, confiere a las células T modificadas genéticamente, la capacidad de eliminar células cancerosas que expresan WT1 endógenamente. Además, los inventores han definido la estructura molecular del RCT, han identificado las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por la siglas Complementar y

Determining Regions) , y describen como fabricar RCT recombinantes que se piensa que conservan la misma especificidad que la de molécula la parental.

Los RCT pueden introducirse de un modo útil en una célula T derivada de un paciente (preferentemente un paciente HLA-A2 positivo) que padece un tumor maligno (en el que las células tumorales del paciente expresan WT1) , y la célula T modificada genéticamente se introduce en el paciente con el fin de combatir el tumor maligno. En particular, se propone extraer células T de pacientes con cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, otros cánceres sólidos o leucemia, transducirlas in vitro con un vector retroviral que contenga los genes del RCT, y reinfundir las células T transducidas en los pacientes. La credibilidad de este enfoque se confirma demostrando en los Ejemplos que los genes del RCT específicos de WT-1 pueden transferirse a células T humanas, que los genes dan lugar a una expresión del RCT en la superficie de células T receptoras, que las células T receptoras pueden eliminar células T diana HLA-A2 positivas recubiertas con el péptido pWT126 y células tumorales HLA-A2 positivas que expresan W1 endógenamente.

Se conoce bien la estructura general de los receptores de células T (RCT) , su estructura de dominios y la organización de los genes que los codifican, véase, por ejemplo, el Capítulo 11 de Immunology, segunda edición (1994) , de Janis Kuby, W H Freeman & Co, Nueva York, EE.UU., y García et al (1999) Ann. Rev. Immunol., 17, 369

397. Una clase común de RCT naturales es la clase αβ en la que los RCT están constituidos por una cadena alfa distinta y una cadena beta distinta que forman un heterodímero que está asociado con la membrana de las células T. Cada cadena alfa y beta está constituida por regiones que, en orden desde el extremo N al extremo C, son una secuencia líder, una región variable, una región constante, una secuencia conectora, una región transmembrana y una región de cola citoplasmática (véase la Figura 14 para una representación gráfica de la estructura del RCT αβ) . La región variable de la cadena alfa se denomina región Vα y la región variable de la cadena beta se denomina región Vβ. De un modo similar, la región constante de la cadena alfa se denomina región Cα y la región constante de la cadena beta se denomina región Cβ. La misión del RCT αβ es reconocer y unirse a un péptido presentado en una molécula de HLA de una célula en el organismo. Hablando de manera general, el RCT no puede reconocer y unirse al péptido a menos que este se presente mediante una molécula de HLA particular, y el RCT no puede reconocer una molécula de HLA a menos que ésta presente el péptido específico. Las células T que alojan un RCT específico se dirigirán a células diana que estén presentando un péptido específico en una molécula de HLA particular en una célula (es decir,... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de receptor de células T (RCT) que contiene una parte de cadena alfa y una parte de cadena beta, en la que la parte de cadena alfa contiene tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) :

CDR1α: SSYSPS; CDR2α: YTSAATL; y CDR3α: WSPFSGGGADGLT o SPFSGGGADGLT, en la que la parte de cadena beta contiene tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) :

CDR1β: DFQATT;

CDR2β: SNEGSKA; y CDR3β: SARDGGEG o RDGGEGSETQY, y 15

en la que en una o más de las CDR se reemplazan hasta tres restos de aminoácidos con otro resto de aminoácido, cuya molécula de RCT puede unirse a un complejo HLA-A2/RFMPNAPYL.

2. Una molécula de RCT de acuerdo con la Reivindicación 1 en la que la CDR3α tiene la secuencia de aminoácidos 20 WSPFSGGGADGLT.

3. Una molécula de RCT de acuerdo con la Reivindicación 1 en la que la CDR3α tiene la secuencia de aminoácidos SPFSGGGADGLT.

4. Una molécula de RCT de acuerdo con la Reivindicación 1 en la que la CDR3β tiene la secuencia de aminoácidos SARDGGEG.

5. Una molécula de RCT de acuerdo con la Reivindicación 1 en la que la CDR3β tiene la secuencia de aminoácidos RDGGEGSETQY. 30

6. Una molécula de RCT de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que la parte de cadena alfa y la parte de cadena beta están presentes en diferentes cadenas polipeptídicas.

7. Una molécula de RCT de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5 en la que la parte de cadena 35 alfa y la parte de cadena beta están presentes en la misma cadena polipeptídica.

8. Una molécula de RCT de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7 en la que las CDR se injertan en una región marco conservada humana.

9. Una molécula de RCT de acuerdo con la Reivindicación 8 en la que la parte de cadena alfa tiene la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 2.

10. Una molécula de RCT de acuerdo con las Reivindicaciones 8 o 9 en la que la parte de cadena beta tiene la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 4. 45

11. Una molécula de RCT de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 10 que es soluble.

12. Un kit de partes que comprende un polinucleótido que codifica la parte de cadena alfa como se define en la

Reivindicación 1 y un polinucleótido que codifica la parte de cadena beta como se define en la Reivindicación 1. 50

13. Una composición que comprende un polinucleótido que codifica la parte de cadena alfa como se define en la Reivindicación 1 y un polinucleótido que codifica la parte de cadena beta como se define en la Reivindicación 1.

14. Un polinucleótido que codifica la molécula de RCT monocatenaria como se define en la Reivindicación 7, o que

codifica la parte de cadena alfa como se define en la Reivindicación 1 y la parte de cadena beta como se define en la Reivindicación 1.

15. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con la Reivindicación 14 o que comprende un polinucleótido que codifica la parte de cadena alfa como se define en la Reivindicación 1 y un polinucleótido que 60 codifica la parte de cadena beta como se define en la Reivindicación 1.

16. Un vector de expresión de acuerdo con la Reivindicación 15 que es un vector retroviral.

17. Una célula hospedadora que comprende un polinucleótido de acuerdo con la Reivindicación 14 o un vector de 65 expresión de acuerdo con las 1. o 16.

18. Una célula hospedadora que comprende un vector de expresión de acuerdo con las 1. o 16.

19. Una célula hospedadora de acuerdo con las 1. o 18 que es una célula T.

20. Una célula hospedadora de acuerdo con la Reivindicación 19 que es una célula T derivada de un paciente.

21. Una célula T, preferentemente una célula T derivada de un paciente, modificada para expresar la molécula de RCT de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11, para su uso para combatir un tumor maligno de expresa WT1 en el paciente, en donde el tumor maligno que expresa WT1 es cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, leucemia, cáncer de ovario, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de tiroides, glioblastoma o sarcoma.

22. La célula T de acuerdo con la Reivindicación 21, para su uso de acuerdo con la Reivindicación 21, en donde un polinucleótido de acuerdo con la Reivindicación 14 o un vector de expresión de acuerdo con las 1.

o 16 se ha introducido en la célula T, preferentemente una célula T derivada del paciente, de tal manera que la 15 célula T expresa la molécula de RCT codificada.

23. La célula T de acuerdo con la reivindicación 22, para su uso de acuerdo con la Reivindicación 22, en donde se ha introducido un vector de expresión en la célula T.

24. Un método de selección de una molécula de RCT con unión mejorada a un complejo HLA-A2/RMFPNAPYL que comprende:

(a) proporcionar una molécula de RCT que contiene una parte de cadena alfa y una parte de cadena beta, en la que la parte de cadena alfa contiene tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) :

CDR1α: SSYSPS; CDR2α: YTSAATL; y CDR3α: WSPFSGGGADGLT o SPFSGGGADGLT, en la que la parte de cadena beta contiene tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) :

CDR1β: DFQATT;

CDR2β: SNEGSKA; y CDR3β: SARDGGEG o RDGGEGSETQY, 35 y en donde en una o más de las CDR como las proporcionadas al menos un resto de aminoácido se reemplaza con otro resto de aminoácido;

(b) determinar si la molécula de RCT se une a un complejo HLA-A2/RFMPNAPYL con mayor afinidad que una 40 molécula de RCT sin el aminoácido (o aminoácidos) de reemplazo; y (c) seleccionar una molécula que se une con mayor afinidad.

25. Un método de acuerdo con la Reivindicación 24 en el que las CDR3 son como se define en cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 5. 45