Materiales biológicos y usos de los mismos.

Un agente para la modulación de una respuesta inflamatoria crónica en la que el agente modula la actividad biológica de tenascina C,

en la que el agente es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que tiene especificidad por el dominio FBG de tenascina C.

Materiales biológicos y usos de los mismos

La presente invención se refiere a tenascina C y su actividad en la inflamación crónica. También se proporcionan moduladores de tenascina C y su actividad biológica.

La inflamación es la respuesta biológica compleja de tejidos a estímulos perjudiciales, tales como patógenos, daño tisular o irritantes. Un intento protector del tejido es retirar los estímulos perjudiciales así como iniciar el proceso de curación para el tejido. Las anomalías asociadas a la inflamación comprenden un gran grupo no relacionado de trastornos que subyacen en diversas enfermedades humanas (trastornos inflamatorios). Los ejemplos de enfermedades con un aspecto inflamatorio incluyen (pero sin limitación) asma, enfermedad autoinmunitaria, glomerulonefritis, alergia (hipersensibilidades), enfermedades inflamatorias del intestino, lesión de reperfusión, artritis reumatoide y rechazo de transplantes.

En particular, la inflamación crónica es una afección debilitante y grave asociada a muchas de las enfermedades anteriores y se caracteriza por la inflamación persistente en un sitio de infección o lesión, o en relación con respuestas inmunitarias alteradas tales como en enfermedad autoinmunitaria.

La artritis reumatoide (AR) es un ejemplo típico, aunque en absoluto el único, de una afección inflamatoria crónica. La AR se caracteriza por inflamación sinovial y destrucción del cartílago y hueso de las articulaciones mediadas por síntesis persistente de citocinas proinflamatorias y metaloproteinasas de matriz (MMP). Los compuestos biológicos que suprimen la síntesis de las citocinas inflamatorias tales como TNFa e IL-6 tienen éxito en el tratamiento de AR a corto plazo. Sin embargo, se requieren tratamientos repetidos, lo que lo hace un enfoque terapéutico caro, y no proporciona remisión a largo plazo. Además, la supresión sistémica total de la función de citocinas tiene problemas inherentes tales como riesgo infeccioso aumentado. Por lo tanto, a pesar de los avances en los cuidados, sigue existiendo una necesidad no satisfecha de un modo económico de tratamiento de inflamación crónica que sea eficaz a largo plazo (Smolen (26) y Williams (27)).

Los mecanismos que respaldan la cronicidad de la enfermedad siguen sin estar claros y el factor o los factores que conducen la expresión prolongada de mediadores inflamatorios y destructivos se desconocen en la actualidad.

Los receptores de tipo toll (TLR) desempeñan un papel clave en la conducción de la producción de mediadores inflamatorios en AR y el bloqueo de la función de TLR puede tener beneficios clínicos significativos (revisado en Brentano (25) y ONelll (22)). Esta familia de receptores forma una parte integral del sistema inmunitario. Los TLR median en la defensa del hospedador contra la infección y lesión reconociendo tanto patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) como patrones moleculares asociados a daño (DAMP) (Matzinger (22)). Los DAMP son moléculas prolnflamatorias endógenas generadas tras la lesión tisular e incluyen moléculas intracelulares liberadas de células dañadas o necróticas, moléculas de fragmentos de la matriz extracelular (ECM) o moléculas ECM reguladas positivas tras la lesión (revisado en Bianchi (27) y Gordon (22)).

Tras la activación, los TLR promueven respuestas inmunitarias tanto innatas como adaptativas incluyendo la estimulación de la expresión de citocinas proinflamatorias y MMP (Medzhitov (22)). Se expresan TLR a altos niveles en tejido sinovial de pacientes con AR (Radstake (24), Roelofs (25), Sacre (27), y Sacre, manuscrito presentado en 28) y se protegen ratones con deleciones dirigidas o mutaciones de pérdida de función en TLR4 de artritis experimental (Choe (23) y Lee (25)). Además, los inhibidores de TLR4 pueden reducir la artritis destructiva en ratones (Abdollahi-Roodsaz (27)) y un inhibidor de TLR4 potencial mejoró los síntomas en 15 de 23 pacientes con AR de moderada a grave en un ensayo de fase I preliminar (Vanags (26)). Sin embargo, no está claro que el ligando o llgandos de TLR están implicados en la patogénesis de enfermedad.

La tenascina C es una glucoproteína de ECM que está asociada con lesión tisular y reparación de heridas. La tenascina C se expresa específicamente durante la remodelación de tejido activo durante la embriogénesis, observándose en primer lugar durante la gastrulación y formación de somitas. En estadios posteriores del desarrollo la expresión se restringe a sitios de morfogénesis de ramificación de la glándula mamaria y el pulmón, en el esqueleto en desarrollo, el sistema cardiovascular y en tejidos conectivos en sitios de transformación de epitelio a mesénqulma. La expresión se regula negativamente una vez que cesan estos procesos y antes de que se complete la embriogénesis (Jones (2)).

La tenascina C normalmente no se expresa en tejido adulto sano pero, en adultos, está regulada positivamente de forma específica y transitoria durante la inflamación aguda y se expresa de forma persistente en inflamación crónica (revisado en Chiquet-Ehrismann (23)). Los estudios inmunohistoquímicos muestran que se expresa poca tenascina C en articulaciones humanas normales pero los niveles aumentan en gran medida en sinovios de AR, en áreas de Inflamación y fibrosis, específicamente por debajo del revestimiento sinovial, en el pannus invasor y en torno a vasos sanguíneos (Cutolo (1992), MacCachren (1992) y Salter (1993)). También hay un aumento significativo de los niveles de tenascina C en el líquido sinovial de pacientes con AR (Chevalier (1994) y Hasegawa (27)) y en cartílago con AR (Salter (1993) y Chevalier (1994)).

La tenascina C es una proteína hexamérica grande de 1,5 millones de Da. Cada cadena comprende diferentes dominios, incluyendo un dominio de ensamblaje (TA), repeticiones de tipo EGF (EGF-L), repeticiones de tipo fibronectina tipo III (TNIII) y un globo de tipo fibrinógeno (FBG) (revisado en Orend (25)). Las secuencias de tenascina C y sus dominios se muestran en la Figura 13.

Anteriormente, el papel de tenascina C en la inflamación ha sido dudoso, con pruebas que mostraban diversos efectos en diferentes células ¡nmunitarias. Por ejemplo, se ha demostrado que la tenascina C apoya la adhesión y rodamiento de linfocitos de las amígdalas y sangre periférica humana primarios, sugiriendo de este modo un papel en la estimulación de la migración de linfocitos (Clark (1997)). Además, los ratones sin tenascina C muestran infiltración de linfocitos reducida y niveles menores de ARNm de IFN, TNF e IL-4 tras la lesión de hígado inducida por concanavalina A en ratones (El-Karef (27)). Por lo tanto, las pruebas sugieren que la tenascina C está implicada en la promoción de la actividad de células inflamatorias agudas. Sin embargo, también se ha indicado que la tenascina C inhibe la quimiotaxis de monocitos in vitro (Loike (21)) y los ratones sin tenascina C muestran migración aumentada de monocitos y macrófagos en estroma de tumor mamario (Talts (1999)). Estas pruebas sugieren por lo tanto que la tenascina C tiene un papel en la inhibición de células inflamatorias.

Los inventores han demostrado que la tenascina C es un ligado de TLR4 endógeno que se requiere para la inflamación de articulaciones destructiva observada en artritis.

Además, se ha demostrado ahora que la tenascina C no está implicada en la inducción de inflamación (respuesta inflamatoria aguda) sino que en su lugar está implicada en la prolongación de la respuesta inflamatoria que caracteriza la afección inflamatoria crónica. En particular, se ha demostrado ahora que la tenascina C es un activador endógeno de TLR4 y se ha demostrado que esta molécula se requiere para la inflamación de las articulaciones destructiva.

Se ha demostrado un papel de la tenascina C en la mediación de una respuesta inmunitaria en las articulaciones mediante inducción de inflamación de articulaciones tras la inyección intraarticular del dominio FBG de tenascina C en ratones in vivo. Además, la inflamación aguda de las articulaciones inducida por zimosano no fue tan prolongada en ratones deficientes en tenascina C. Los ratones tanto de tipo silvestre como sin tenascina C respondieron a inducción de inflamación aguda por zimosano igualmente, demostrando que la tenascina C no parece estar implicada en el inicio de la inflamación. Sin embargo, la sinovitis menos persistente mostrada por los ratones sin tenascina C indica un papel en el mantenimiento de la inflamación de articulaciones. La importancia de la tenascina C en la prolongación de la inflamación de articulaciones se subrayó por la observación de que la deleción dirigida de tenascina C protegió a los ratones de inflamación sostenida erosiva de las articulaciones... [Seguir leyendo]

1. Un agente para la modulación de una respuesta inflamatoria crónica en la que el agente modula la actividad biológica de tenascina C, en la que el agente es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que tiene especificidad por el dominio FBG de tenascina C.

2. Un agente de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el agente modula la actividad biológica de tenascina C alterando las propiedades de unión de tenascina C.

3. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2 siendo el agente un inhibidor de las propiedades de unión de tenascina C, o siendo el agente un inhibidor de la unión competitiva de tenascina C.

4. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en fragmentos Fv, fragmentos scFv, Fab, dominios variables individuales y anticuerpos de dominio, y en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo están opcionalmente humanizados.

5. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en donde la respuesta inflamatoria crónica está asociada a una afección caracterizada por inflamación inapropiada, por ejemplo en donde la respuesta inflamatoria crónica está asociada a artritis reumatoide (AR), afecciones autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias del intestino, heridas que no se curan, esclerosis múltiple, cáncer, aterosclerosis, enfermedad de Sjogren, diabetes, lupus eritematoso (incluyendo lupus eritematoso sistémico), asma, enfermedades fibróticas (incluyendo cirrosis hepática), fibrosis pulmonar, daño por UV y psoriasis.

6. Una composición que comprende un agente como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un vehículo, un excipiente y/o un diluyente farmacéuticamente aceptables y opcionalmente que comprende además al menos otro agente.

7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el al menos otro agente es un agente antiinflamatorio (por ejemplo antiinflamatorios no esteroideos (AINE), corticosteroides, fármacos antirreumáticos modificadores de enfermedad (DMARD) o inmunosupresores, una estatina, un agente biológico (productos biológicos), un agente inmunosupresor, un salicilato y/o un agente microbicida.

8. Un agente o una composición como se definen en las reivindicaciones 1-7 para uso en el tratamiento de una afección inflamatoria crónica, en donde la respuesta inflamatoria crónica se asocia a artritis reumatoide (AR), enfermedades inflamatorias del intestino, aterosclerosis y/o psoriasis.

9. Uso de un agente o de una composición como se definen en las reivindicaciones 1-7 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección inflamatoria crónica, en donde la respuesta inflamatoria crónica está asociada a artritis reumatoide (AR), enfermedades inflamatorias del intestino, aterosclerosis y/o psoriasis.

1. Un kit de partes que comprende:

(i) un agente o una composición como se definen en las reivindicaciones 1-7

(ii) medios de administración

(iii) instrucciones para su uso

y que comprende opcionalmente además

(iv) al menos otro agente.