Procedimiento de proliferación de células LAK.

Un procedimiento para la proliferación de células LAK, que comprende las siguientes etapas en orden numérico:

(1) una etapa de proliferación/activación haciendo proliferar y activando las células en un especimen de partidaque contiene células T tipo ab obtenidas de un perro o un gato, mediante el cultivo de las células en un medio decultivo suplementado con al menos una lectina vegetal y un factor de crecimiento que tenga una actividad similara la interleucina-2, en el que la lectina vegetal es 1 - 15 μg/ml de concanavalina A y el factor de crecimiento es500 - 750 U/ml de interleucina-2.

Procedimiento de proliferación de células LAK

Campo de la técnica La presente invención se refiere a un procedimiento para la proliferación de células LAK, y un kit de cultivo celular para su uso en la proliferación de células LAK.

Antecedente de la técnica Generalmente se conoce en la técnica que un procedimiento de tratamiento, tal como una terapia quirúrgica eliminando un área afectada por una lesión, una quimioterapia administrando agentes contra el cáncer, y una terapia por radiación aplicando radiación a un área afectada por una lesión, se puede utilizar como un medio para tratar

cánceres y/o tumores.

Sin embargo, estas terapias implican algunas desventajas para los pacientes tales como una carga física importante y efectos adversos asociados con los agentes químicos o la radiación ionizante. Así, desde los años 80, como cuarta terapia, se investiga una terapia que utiliza linfocitos autólogos activados, tal como la terapia con LAK (linfocitos citolíticos activados por linfoquinas) y la terapia CTL (linfocitos T citotóxicos) , y que se han llegado a utilizar para tratar enfermedades cancerosas humanas (véase, Documento no patente1) .

En la técnica, la expresión “terapia LAK” se refiere a un procedimiento para tratar un cáncer en un paciente utilizando la inmunidad ejercida por linfocitos autólogos del paciente, que se hicieron proliferar y se activaron ex vivo.

Específicamente “terapia LAK” es un procedimiento para tratar un cáncer mediante las etapas siguientes: (1) extracción de sangre de un paciente que padece un cáncer, y aislamiento de una fracción que contiene los linfocitos;

(2) proliferación y activación de los linfocitos cultivando así la fracción aislada en un medio de cultivo suplementado con interleucina-2 y anticuerpos anti-CD3 durante aproximadamente dos semanas; (3) lavado de la suspensión celular obtenida que contiene una cantidad de linfocitos, eliminando la interleucina-2, el anticuerpo anti-CD3, y el medio de cultivo de las células, y suspendiendo los linfocitos obtenidos en una solución apropiada (tal como solución salina fisiológica para infusión que contenga una albúmina) para preparar una formulación celular, y (4) administración de la formulación celular para devolver los linfocitos activados al cuerpo del paciente. También, la terapia CTL es un procedimiento que utiliza linfocitos T citotóxicos, en lugar de células LAK, después de la proliferación y activación de los linfocitos T citotóxicos.

Otra terapia es una terapia que utiliza linfocitos autólogos activados que se ha mejorado en varios puntos. Por ejemplo, cultivando una suspensión celular que contiene los linfocitos autólogos en un medio de cultivo suplementado con mitógenos de células T (tales como la concanavalina A) y citoquinas (tales como la interleucina 7) , en lugar de un anticuerpo anti-CD3. Se ha desarrollado en la técnica (véase, Documentos patentes 1 y 2) un procedimiento para tratar eficazmente el cáncer por proliferación / activación específica de células T tipo γd (que están implicadas directamente en la inmunidad mediada por células) , en vez de activar todos los linfocitos. También se ha descrito un procedimiento para preparar células LAK a partir de las PBMC obtenidas de gatos infectados con VIF, en las que las PBMC se tratan primero con 5 microgramos/ml de ConA durante 24 h y luego se lavan antes de tratarse con IL-2 a 2 U/ml (Documento no patente 2) .

En la técnica, la terapia que utiliza linfocitos autólogos activados (tal como la terapia LAK o la terapia CTL) se ha intentado aplicar en enfermedades distintas del cáncer (tales como enfermedades inmunológicas o enfermedades infecciosas) , como se describe en los Documentos Patentes 1 y 2.

Sin embargo, hay algunos problemas a resolver tales como los siguientes. Primero, como la proteína CD3 que se utiliza como inmunógeno para obtener un anticuerpo anti-CD3 varía según la especie que la origina (tales como un perro, un gato, animales domésticos, y un ser humano) , los anticuerpos anti-CD3 se tienen que preparar para cada especie a tratar. Además, los anticuerpos anti-CD3, especialmente los anticuerpos anti-CD3 que se utilizan últimamente en la técnica para seres humanos, son muy caros. Por lo tanto, se considera que la terapia que utiliza 55 los linfocitos autólogos activados (tales como terapia LAK o terapia CTL) es difícil de aplicar en animales no humanos, desde el punto de vista económico.

También se considera como un problema el que, como las células T tipo γd, incluso en las células T tipo γd en proliferación, no han demostrado una especifidad antigénica o restricción MHC, las células T tipo γd no son útiles para la terapia que utiliza los linfocitos autólogos activados (tales como terapia LAK o terapia CTL) .

Documento Patente 1: Anuncio Nacional de Patente Japonesa Nº 2002-528115 (JP-2002-528115-W) Documento Patente 1: Anuncio Nacional de Patente Japonesa Nº 2003-529363 (JP-2003-529363 -W) Documento no Patente 1 [hecha la búsqueda el 27 de junio de 2006], en internet <URL: http://www.j

immunother.com/treatment/02Treatment.html> Documento no Patente 2: Zhao y col., 1995, Journal of Leukocyte Biology, 58:423-431

Divulgación de la invención

Problemas a resolver por la invención La presente solicitud pretende proporcionar un procedimiento de tratamiento eficaz para varios cánceres, enfermedades de inmunodeficiencia e infecciones, y un procedimiento de proliferación / activación de células asociado con el mismo, que se pueda llevar a cabo a tal bajo coste que los procedimientos se puedan aplicar a animales no humanos.

Medios para resolver los problemas La característica principal de la presente invención la suplementación a un medio de cultivo de una lectina vegetal (tal como la concanavalina A) y un factor de crecimiento que tenga una actividad similar a la interleucina-2, después de cultivar las células obtenidas de un especimen de partida.

Breve descripción de los dibujos [FIG. 1] La FIG. 1 es un gráfico que muestra el efecto de las diferencias de concentración de concanavalina A en un medio de cultivo sobre la proliferación de las células T tipo aβ. [FIG. 2] La FIG. 2 es un gráfico que muestra el efecto de la presencia o ausencia de concanavalina A en un medio de cultivo sobre la expresión del receptor interleucina-2 en la superficie de los linfocitos periféricos caninos. [FIG. 3] La FIG. 3 es un gráfico que muestra el efecto de las diferencias de la concentración de suero en un medio de cultivo sobre la proliferación de las células T tipo aβ.

[FIG. 4] La FIG. 4 es un gráfico que muestra el efecto de las diferencias de concentración de interleucina-2 en un medio de cultivo sobre la proliferación de las células T tipo aβ. [FIG. 5] La FIG. 5 es un gráfico que muestra el resultado del cultivo de las células T tipo aβ obtenidas de diferentes perros en presencia del suero autólogo de cada perro. [FIG. 6] La FIG. 6 es un gráfico que muestra el resultado del cultivo de las células T tipo aβ obtenidas de diferentes perros en presencia de suero fetal bovino. [FIG. 7] La FIG. 7 es un gráfico que muestra el resultado del cultivo de las células T tipo aβ obtenidas de diferentes gatos en presencia del suero autólogo de cada gato o suero fetal bovino. [FIG. 8] La FIG. 8 muestra los histogramas de citometría de flujo medida antes y después de la proliferación de las células.

[FIG. 9] La FIG. 9 es un gráfico que muestra el resultado de la citotoxicidad de los linfocitos periféricos de perro cultivados en un medio de cultivo suplementado con concanavalina A e interleucina-2 contra las células de melanoma humano. [FIG. 10] La FIG. 10 es una fotografía de la electroforesis que muestra el efecto del cultivo de los linfocitos periféricos de perro en un medio de cultivo suplementado con concanavalina A e interleucina-2 sobre la actividad de la granzima B de transcripción del ARNm. [FIG. 11] La FIG. 11 es un gráfico que muestra la citotoxicidad de los linfocitos periféricos contra las células de melanoma humano, en la que los linfocitos periféricos se obtuvieron por las siguientes etapas de: cultivo de los linfocitos periféricos de perro en un medio de cultivo suplementado con concanavalina A e interleucina-2, transferencia de los linfocitos periféricos de perro cultivados al perro en el que se originaron los linfocitos, y

obtención de linfocitos periféricos del perro transferido. [FIG. 12] La FIG. 12 muestra fotografías que muestran los cambios de un sitio afectado del perro que padece cáncer, al que se le ha sometido al procedimiento de tratamiento de la presente... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la proliferación de células LAK, que comprende las siguientes etapas en orden numérico:

(1) una etapa de proliferación/activación haciendo proliferar y activando las células en un especimen de partida que contiene células T tipo aβ obtenidas de un perro o un gato, mediante el cultivo de las células en un medio de cultivo suplementado con al menos una lectina vegetal y un factor de crecimiento que tenga una actividad similar a la interleucina-2, en el que la lectina vegetal es 1 – 15 μg/ml de concanavalina A y el factor de crecimiento es 500 – 750 U/ml de interleucina-2.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el especimen de partida que contiene células T tipo aβ se selecciona de entre al menos uno de los componentes que consisten en sangre periférica, médula ósea, tejido linfático, epitelio, timo, hígado, bazo, tejido canceroso, tejido infectado, tejido ganglionar linfático, tejido embrionario y fracciones de los mismos.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el especimen de partida se selecciona de entre al menos uno de los componentes que consisten en sangre periférica y fracciones de los mismos.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además las siguientes etapas en 20 orden numérico:

(2) una etapa de eliminación eliminando el medio de cultivo y lavando las células tras la etapa de proliferación / activación; y

(3) una etapa de producción suspendiendo las células lavadas en una solución apropiada. 25

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en la que la concentración de concanavalina A contenida en el medio de cultivo es de 5 μg/ml.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 – 4 y 5, en el que la concentración de interleucina-2 30 es de 750 U/ml.

7. Un kit de proliferación de células LAK obtenidas de un perro o de un gato individuales que comprende un medio de crecimiento que contiene al menos una lectina vegetal y un factor de crecimiento que tiene una actividad similar a la interleucina-2,

en el que la lectina vegetal es 5 μg/ml de concanavalina A y el factor de crecimiento es 500 - 750 U/ml de interleucina-2, la lectina vegetal es 1 – 15 μg/ml de concanavalina A y el factor de crecimiento es 750 U/ml de interleucina-2, o la lectina vegetal es 5 μg/ml de concanavalina A y el factor de crecimiento es 750 U/ml de interleucina-2.

8. El kit de la reivindicación 7 que contiene un recipiente de cultivo celular.

Origen 1 Origen 2 Origen 3 Origen 4

Linaje 1 Linaje 2 Linaje 3 Linaje 4