Potenciación de la producción a través de transducción mecánica.

Un método para aumentar la producción de un anticuerpo de interés de una célula huésped,

que comprende someter dicha célula a una fuerza de tensegridad, donde la fuerza de tensegridad se aplica a la célula en una cantidad eficaz para aumentar la producción de dicho anticuerpo por la célula.

Potenciación de la producción a través de transducción mecánica Antecedentes de la invención

Las células de ovario de hámster chino (CHO) son la línea celular huésped de mamífero de uso más habitual para producir proteínas recombinantes en la industria biofarmacéutica. Los procesos de cultivo celular con células de mamífero, incluidas las células CHO, para producir bioterapéuticas se enfrentan con diversos retos, incluidas las comprimidas líneas de tiempo para el desarrollo del producto, escaseces y limitaciones de la proliferación y productividad de las líneas celulares.

La presente invención aborda estos aspectos aplicando un modelo de tensegridad a las células de mamífero, tales como células CHO. Aplicando fuerzas de tensegridad a estas células se puede aumentar el nivel de anticuerpo recombinante producido por las células.

Sumario de la invención

La presente invención está dirigida a métodos para aumentar la producción de un anticuerpo de interés de una célula huésped, que comprende someter dicha célula a una fuerza de tensegridad, donde la fuerza de tensegridad se aplica a la célula en una cantidad eficaz para aumentar la producción de dicho anticuerpo por la célula. Los métodos de la Invención están dirigidos a aumentar la producción de un anticuerpo diana de células y/o cultivos celulares. Las fuerzas de tensegridad puede ser una tensión que se aplica a las células y puede Incluir uno o más de los siguientes: tensión mecánica, tensión de clzalladura, efectos de estiramiento y tensión inducida por presión, por ejemplo, presión Inducida por ondas de sonido. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es una IgG. En determinadas realizaciones, las células son células de ovario de hámster chino (CHO).

En determinadas realizaciones, las células están flotando en libertad en un cultivo. En realizaciones alternativas, las células son células adherentes capaces de adherirse a un sustrato.

En determinadas realizaciones, la presente Invención está dirigida a métodos de aumentar la producción de un anticuerpo recombinante de las células de un cultivo celular aplicando una tensión a las células. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es una IgG. En determinadas realizaciones, las células son células de ovario de hámster chino (CHO).

En determinadas realizaciones de la presente invención, las células sometidas a tensión están cultivadas en un biorreactor comercial.

Un método de la presente invención implica someter a las células que expresan un anticuerpo de interés a una tensión de cizalladura mecánica controlada. En determinadas realizaciones, la tensión por cizalladura (par) se puede aplicar a la superficie de una célula usando perlas ferromagnéticas unidas a membrana recubiertas con anticuerpos que se pueden adherir al citoesqueleto de las células. Las perlas se pueden magnetizaren una dirección aplicando un campo magnético de torsión más débil.

Métodos alternativas de la presente invención implican someter a las células que expresan un anticuerpo de interés a un sistema de cultivo biomecánico capaz de someter a las células adherentes a diversas condiciones de cultivo en tensión biaxial/deformación. En determinadas realizaciones, el sistema de cultivo biomecánico es microscopía de tracción. En determinadas realizaciones, el sistema de cultivo biomecánico permite la obtención de imágenes microscópicas vivas de las células.

En determinadas realizaciones, se puede medir la viabilidad de las células sometidas a tensión. Ejemplos no limitantes de dichos ensayos de viabilidad celular incluyen, entre otros, ensayos de captación de pigmentos (p. ej., ensayos con calceína AM), ensatos de viabilidad celular XTT y ensayos de exclusión de pigmentos (p. ej., ensayos de exclusión de pigmentos con azul tripán, eosina o propidio).

En determinadas realizaciones, se puede analizar la cantidad de anticuerpo secretado por las células sometidas a tensión. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es una IgG que e libera al medio que forma el microambiente de las células.

En determinadas realizaciones, se puede analizar el comportamiento de las células sometidas a tensión. Dicho comportamiento celular incluye, entre otros, la migración y la morfología celular. En determinadas realizaciones se pueden usar técnicas microscópicas, tales como, entre otras, microscopía electrónica de barrido, microscopía de contraste de fases y/o microscopía electrónica de transmisión, con el fin de evaluar los cambios en el comportamiento de las células con el tiempo.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 Diagrama de flujo que describe la secuencia de procedimientos experimentales para estudiar el modelo de tensegrldad en las células CHO.

Descripción detallada de la invención

La presente invención está dirigida a métodos de aumentar la producción de anticuerpos a través de la aplicación de

fuerzas de tensegridad en células y cultivos celulares. Las fuerzas de tensegridad puede ser una tensión que se

aplica a las células y puede incluir uno o más de los siguientes: tensión mecánica, tensión de cizalladura, efectos de estiramiento y tensión Inducida por presión, por ejemplo, tensión Inducida por ultrasonidos.

Por claridad y no a modo de limitación, esta descripción detallada se divide en las siguientes subsecciones:

1. Métodos de aplicación de fuerzas de tensegridad;

2. Modulación de la producción de proteínas diana a través de la aplicación de fuerzas de tensegridad; y

3. Producción a gran escala incorporando optimización de la fuerza de tensegridad.

1. Métodos de aplicación de fuerzas de tensegridad

La presente invención está dirigida a métodos de aumentar la producción de anticuerpos a través de la aplicación de

fuerzas de tensegridad en células y cultivos celulares. En el modelo de tensegridad celular, las fuerzas de tensión

son portadas por los microfilamentos del citoesqueleto y los filamentos intermedios y estás fuerzas se equilibran mediante elementos estructurales interconectados que resisten a la compresión, muy probablemente, adhesiones de hileras de microtúbulos y de la matriz extracelular (MEC). (Véase, por ejemplo, D.E., Tensegrity: the architectural basis of cellular mechanotransduction. Annu Rev Physiol, 1997. 59: pág. 575-99; Ingber, D.E., Tensegrity II. How structural networks influence cellular information processing networks. J Cell Sci, 23. 116 (Pt 8): pág. 1397-48; Ingber, D.E., Tensegrity I. Cell structure and hierarchical systems biology. J Cell Sci. 23 Apr 1; 116 (Pt 7): 1157-73; y Wang, N., J.D. Tytell, y D. Ingber, Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with nucleus. Molecular cell biology, January 29. 1: pág. 75-82). Dichas fuerzas de tensegridad pueden incluir fuerzas de tensión, por ejemplo tensión mecánica dirigida a las células diana o a los cultivos celulares.

En determinadas realizaciones, las fuerzas de tensegridad se reciben y la señal se transluce al interior de una célula mediante un equilibrio de fuerzas complementarias entre microfilamentos tensados, microtúbulos comprimidos y receptores de integrina transmembrana en las células vivas. Cuando la fuerza se aplica a las integrinas, los parámetros termodinámicos y cinéticos pueden cambiar localmente para las moléculas asociadas al citoesqueleto que experimentan físicamente la carga mecánica. Cuando se aplica fuerza a receptores de no adhesión que no se unen al citoesqueleto, la tensión se disipa localmente en la superficie celular y se silencia la respuesta bioquímica. En un ejemplo no limitante, cuando se aplica tensión a las integrinas se añaden nuevos monómeros de tubulina al extremo de un microtúbulo y el microtúbulo se descomprime como resultado de un cambio en la concentración crítica de tubulina. En determinadas realizaciones, las moléculas que están físicamente distorsionadas por la tensión transferida desde las integrinas al citoesqueleto pueden cambiar su cinética, por ejemplo aumentando su constante de velocidad para la conversión química de un sustrato en un producto. De este modo, tanto la estructura del citoesqueleto (arquitectura) como el preesfuerzo (tensión) en el citoesqueleto pueden modular la respuesta celular a la tensión mecánica.

En determinadas realizaciones, la aplicación de la fuerza a través del citoesqueleto se puede transducir a los poros nucleares de una célula y el estiramiento del poro, abriendo los cestillos y otros componentes del complejo del poro nuclear Interno, altera la cinética de la abertura del poro o modula su composición molecular de modo que se aumenta... [Seguir leyendo]

1. Un método para aumentar la producción de un anticuerpo de interés de una célula huésped, que comprende someter dicha célula a una fuerza de tensegridad, donde la fuerza de tensegridad se aplica a la célula en una

cantidad eficaz para aumentar la producción de dicho anticuerpo por la célula.

2. El método de la reivindicación 1, donde la fuerza de tensegridad es una tensión de clzalladura mecánica.

3. El método de la reivindicación 1, donde la célula se adhiere a un sustrato y la fuerza de tensegridad es una

tensión biaxial.

4. El método de la reivindicación 1, donde la célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO).

5. El método de la reivindicación 1, donde el anticuerpo es ABT-874.

6. El método de la reivindicación 1, donde la célula se subcultiva en un biorreactor.

7. El método de la reivindicación 7, donde la célula se adhiere a un sustrato.

8. El método de la reivindicación 1, donde la fuerza de tensegridad es una presión acústica cíclica.

9. El método de la reivindicación 8, donde la presión acústica cíclica es ultrasonido.

1. El método de la reivindicación 2, donde la célula se pone en contacto con una microperla ferromagnética y donde 25 se aplica una fuerza magnética a la microperla ferromagnética.