Polipéptidos híbridos hipoalergénicos para el tratamiento de alergia.

Un polipéptido hipoalergénico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 22, 23, 24, 25, 36 y 37.

Polipéptidos híbridos hipoalergénicos para el tratamiento de alergia

Antecedentes de la invención Más del 10 % de la población mundial sufre alergia al polen de gramíneas. Aquí, los presentes inventores describen el

desarrollo de una vacuna basada en moléculas híbridas hipoalergénicas recombinantes que se construyeron a partir de elementos derivados de los cuatro principales alérgenos del polen de hierba timotea Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 y Phl p 6 para el tratamiento de alergia al polen de gramíneas. Los genes sintéticos de codones optimizados que codifican bloques de construcción y combinaciones de los cuatro alérgenos se diseñaron según estudios de mapeo de epítopes y datos estructurales y posteriormente se expresaron en Escherichia coli. Diecisiete moléculas híbridas recombinantes se purificaron por cromatografía de afinidad y se evaluaron con respecto a la expresión, pureza y plegamiento, solubilidad y actividad alergénica reducida. Se identificaron cuatro moléculas híbridas hipoalergénicas que consisten en elementos reensamblados de los cuatro alérgenos del polen de gramíneas que tras la inmunización en diferentes modelos animales indujeron anticuerpos IgG que bloquean el reconocimiento de IgE de los alérgenos del polen de gramíneas por pacientes alérgicos. Estas moléculas híbridas hipoalergénicas representan vacunas seguras para la inmunoterapia de la alergia al

polen de gramíneas.

Las alergias mediadas por IgE representan un problema de salud en el mundo con prevalencia creciente (1) . El distintivo de la enfermedad alérgica es la producción de anticuerpos IgE específicos para alérgenos medioambientales, principalmente del polen, ácaros, caspa animal y mohos (1) . Los síntomas alérgicos se producen cuando la IgE unida al receptor sobre mastocitos o basófilos se entrecruza por alérgeno multivalente, conduciendo a la liberación de mediadores 20 inflamatorios (2) . Además, la presentación facilitada por IgE mediante Fc!RI y Fc!RII sobre células presentadoras de antígeno potencia fuertemente la activación de linfocitos T específicos para alérgenos que contribuye a inflamación alérgica mediada por linfocitos T (3, 4) . La inmunoterapia específica para alérgenos actualmente representa el único tratamiento etiológico de alergias con efecto a largo plazo, aunque su éxito está alterado por el uso de extractos de alérgeno en bruto (5, 6) . Estas preparaciones contienen material alergénico y no alergénico en cantidades variables, por lo 25 que la presencia de compuestos biológicamente activos aumenta el riesgo de efectos secundarios anafilácticos. Además, la falta de o escasa inmunogenicidad de alérgenos clínicamente relevantes reduce la eficacia de vacunas basadas en extractos (7) . Se ha hecho un progreso sustancial en el campo de la caracterización de alérgenos durante los últimos 20 años mediante la aplicación de técnicas inmunoquímicas y de biológica molecular. Hoy en día, los alérgenos más comunes e importantes se han caracterizado con respecto a su estructura y propiedades inmunológicas. Se han 30 producido alérgenos recombinantes que se parecen mucho a las propiedades de los alérgenos naturales y pueden ahora usarse para el diagnóstico y terapia de alergia (5) . Además, se ha mostrado que pueden manipularse los derivados de alérgenos con propiedades inmunológicas beneficiosas (8) . Se han generado variantes modificadas de alérgenos con actividad alergénica con el fin de evitar los efectos secundarios mediados por IgE en el transcurso de la inmunoterapia y ya se han usado fragmentos derivados de Bet v 1 recombinantes con capacidad de unión a IgE fuertemente reducida en un ensayo clínico (9) . Moléculas híbridas que consisten en combinaciones de diferentes alérgenos han mostrado que aumentan la inmunogenicidad de sus componentes individuales (10-12) .

Linhart y col. (Ref. 21) prepararon una molécula híbrida hipoalergénica con elevada inmunogenicidad combinando derivados hipoalergénicos de los dos principales alérgenos del polen de gramíneas Phl p 2 y Phl p 6, concretamente una molécula del mosaico de Phl p 2 y un mutante de deleción de Phl p 6, lo cual no fue sorprendente en vista de datos previos (Ref. 15, 17) .

El documento EP 1219301 A1 desvela polipéptidos híbridos que consisten en al menos dos proteínas alergénicas diferentes o fragmentos de las mismas.

El documento WO 2007/124526 A1 describe procedimientos para producir derivados del alérgeno de proteína natural Phl p 1 con actividad alergénica reducida que comprenden fragmentar el alérgeno de proteína natural y volver a unir los 45 fragmentos en un orden diferente.

El documento EP 1440979 A1 desvela un procedimiento para la preparación de proteínas de mosaico hipoalergénicas que comprende fragmentar el alérgeno en fragmentos sin reactividad de IgE y volver a unir los fragmentos en un orden diferente.

Schramm y col. (1999) The Journal of Immunology, 162, páginas 2406-2414, describen la producción de variantes del 50 alérgeno Phl p 5 con capacidad de unión a IgE reducida, pero reactividad de linfocitos T conservada.

Westritschnig y col. (2007) The Journal of Immunology, 179, páginas 7624-7634, investigan una vacuna hipoalergénica obtenida por reestructuración de la cola a la cabeza de Phl p 12 para el tratamiento de sensibilización cruzada a profilina.

Los presentes inventores han encontrado ahora que una combinación de la tecnología híbrida y la tecnología de mosaico no conduce en todos los casos a moléculas hipoalergénicas. Sorprendentemente, se ha observado que dos polipéptidos de fusión que consistieron en los mismos fragmentos, pero en un orden diferente, presentaron reactividades de IgE muy diferentes. Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para identificar polipéptidos que tienen propiedades hipoalergénicas y pueden servir de posible vacuna.

Resumen de la invención La presente invención se refiere a un polipéptido hipoalergénico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 22, 23, 24, 25, 36 y 37.

En una realización, el polipéptido hipoalergénico consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 39, 40, 41, 42, 53 y 54.

Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la invención y un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención es el uso del polipéptido de la invención para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de alergia, preferentemente de alergia al polen de gramíneas.

Otro aspecto de la invención es un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 representa el diseño de moléculas híbridas por el ensamblaje de fragmentos de alérgenos derivados de los principales alérgenos del polen de la hierba timotea Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 y Phl p 6 (véase el Ejemplo 1) .

La Figura 2 muestra un gel de PAA teñido con Coomassie que contiene las proteínas híbridas purificadas A-Q (véase el Ejemplo 1) . Los pesos moleculares se indican en el margen izquierdo (m, marcador de peso molecular) .

La Figura 3 muestra los espectros de CD en el UV lejano de las proteínas B, C, P y Q disueltas en agua recogidos en un espectropolarímetro Jasco J-810 (Japan Spectroscopic Co., Tokio, Japón) , véase el Ejemplo 2.

La Figura 4 representa la reactividad de IgE sobre híbridos unidos a nitrocelulosa y proteínas de control para tres pacientes alérgicos al polen de gramíneas representativos (véase el Ejemplo 3) .

La Figura 5 representa reactividad alergénica reducida de híbridos en comparación con los alérgenos naturales 25 como se detecta por expresión de CD203c (véase el Ejemplo 4) .

La Figura 6 representa reactividad de IgG después de la inmunización de ratones con una mezcla de Phl p 1 y Phl p 5, o una mezcla de Phl p 2 y Phl p 6, o una mezcla de B y C, o P o Q. El desarrollo de niveles de anticuerpos IgG1 específicos para Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 y Phl p 6 se comparó por medidas de ELISA (véase el Ejemplo 6) .

La Figura 7 muestra los resultados del Ejemplo 7. La figura representa la reactividad de IgG después de la inmunización de conejos con B, C, P o Q, concretamente respuestas de anticuerpos IgG a los alérgenos naturales Phl p 1 (Figura 7A) , Phl p 5 (Figura 7B) , Phl p 2 y Phl p 6 (Figura 7C) .

La Figura 8 representa la reactividad de IgG después de la inmunización de conejos con B, C, P o HPG (un híbrido derivado de alérgenos del polen de gramíneas descrito en la Ref. 11) , concretamente... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido hipoalergénico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 22, 23, 24, 25, 36 y 37.

2. El polipéptido hipoalergénico de la reivindicación 1, que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del 5 grupo que consiste en SEC ID Nº: 39, 40, 41, 42, 53 y 54.

3. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la reivindicación 1 ó 2 y un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

4. El uso del polipéptido de la reivindicación 1 ó 2 para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de alergia.

5. El uso de la reivindicación 4, en el que dicha alergia es alergia al polen de gramíneas.

6. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la reivindicación 1 ó 2.