Polipéptidos con actividad de esterasa de acetilxilano y polinucleótidos que codifican los mismos.

Un polipéptido aislado con actividad de acetilxilano esterasa,

seleccionado del grupo que consiste en:

un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 85% de identidad con el polipéptido maduro de la SEQ ID nº: 2;

un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida al menos bajo condiciones de astringencia altas con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID nº: 1, (ii) la secuencia de ADNc contenida en la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID nº: 1, o (iii) una cadena complementaria entera de (i) o (ii);

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID nº: 1.

Polipéptidos con actividad de esterasa de acetilxilano y polinucleótidos que codifican los mismos.

Referencia a un listado de secuencias 5

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Referencia a un depósito de Material biológico 10

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Antecedentes de la invención 15

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad de acetilxilano esterasa y polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores y 20 células huésped que comprenden los polinucleótidos así como a métodos para producir y utilizar los polipéptidos.

Descripción de las técnicas relacionadas

Los polisacáridos de la pared celular vegetal constituyen generalmente el 90% de la pared celular vegetal y se 25 pueden dividir en tres grupos: celulosa, hemicelulosa y pectina. La celulosa representa el constituyente principal de los polisacáridos de la pared celular. Las hemicelulosas son el segundo constituyente más abundante de las paredes celulares vegetales. El polímero principal de hemicelulosa es el xilano. La estructura de los xilanos encontrados en paredes celulares vegetales puede diferir significativamente dependiendo de su origen, pero siempre contienen un esqueleto de D-xilosa enlazado en beta-1, 4. El esqueleto de D-xilosa enlazado en beta-1, 4 se puede sustituir por varios 30 grupos laterales, tales como L-arabinosa, D-galactosa, acetilo, feruloilo, p-cumaroilo y residuos de ácido glucurónico.

La biodegradación del esqueleto de xilano depende de dos clases de enzimas: endoxilanasas y beta-xilosidasas. Las endoxilanasas (EC 3.2.1.8) disocian el esqueleto de xilano en oligosacáridos más pequeños, que pueden ser además degradados a xilosa por las beta-xilosidasas (EC 3.2.1.37) . Otras enzimas implicadas en la degradación de 35 xilano incluyen, por ejemplo, acetilxilano esterasa, arabinasa, alfa-glucuronidasa, feruloil esterasa y esterasa de ácido p-cumárico.

La acetilxilano esterasa (EC 3.1.1.6) elimina los grupos de O-acetilo de las posiciones 2 y/o 3 en los residuos beta-D- xilopiranosilo de acetilxilano. El acetilxilano juega un papel importante en la hidrólisis de xilano debido a que los 40 grupos laterales acetilo pueden interferir estéricamente con la aproximación de las enzimas que disocian el esqueleto. La eliminación de los grupos laterales acetilo facilita la acción de las endoxilanasas. Un sistema de clasificación para carbohidrato esterasas, basado en la similitud de secuencias, ha llevado a la definición de 13 familias, siete de las cuales contienen acetilxilano esterasas (Henrissat B., 1991, Biochem. J. 280: 309-316, y Henrissat y Bairoch, 1996, Biochem. 45

J. 316: 695-696) .

Margolles-Clark et al., 1996, Eur. J. Biochem. 237: 553-560, describe una acetilxilano esterasa de Trichoderma reesei. Sundberg y Poutanen, 1991, Biotechnol. Appl. Biochem. 13: 1-11, describe la purificación y propiedades de dos acetilxilano esterasas Trichoderma reesei. WO 2005/001036 describe un gen de acetilxilano esterasa de Trichoderma 50 reesei. U.S. Patent nº 5, 681, 732 describe un gen de acetilxilano esterasa de Aspergillus niger. U.S. Patent nº 5, 763, 260 describe métodos para alterar las propiedades del xilano acetilado.

La patente japonesa nº JP2001054383 describe una acetilxilano esterasa de Chaetomium gracile y usa dicha enzima en composiciones de pienso opcionalmente junto con otras enzimas descomponedoras de xilano. 55

La presente invención se refiere a polipéptidos con actividad de acetilxilano esterasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos.

Resumen de la invención 60

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad de acetilxilano esterasa seleccionados del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad con el polipéptido maduro de la SEQ ID nº : 2; 65

(b) un polipéptido codificado por un polinucleótido, que se hibrida al menos bajo condiciones de astringencia altas con (i)

la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID nº : 1, (ii) la secuencia de ADNc contenida en la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID nº : 1, o (iii) una cadena complementaria entera de (i) o (ii) ;

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido, que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID nº : 1; y

La presente invención también se refiere a polipéptidos que codifican polinucleótidos aislados que tienen actividad de acetilxilano esterasa, seleccionados del grupo que consiste en:

(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 85% de identidad con el polipéptido maduro de la SEQ ID nº : 2; 10

(b) un polinucleótido que se hibrida al menos bajo condiciones de astringencia altas con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID nº : 1, (ii) la secuencia de ADNc contenida en la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID nº : 1, o (iii) una cadena complementaria entera de (i) o (ii) ;

(c) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID nº : 1; y 15

La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células huésped recombinantes que comprenden los polinucleótidos y métodos para producir un polipéptido con actividad de acetilxilano esterasa.

La presente invención también se refiere a métodos para inhibir la expresión de un polipéptido con actividad de acetilxilano esterasa en una célula, que comprenden administrar a la célula o expresar en la célula una molécula de ARN bicatenario (ARNdc) , donde el ARNdc comprende una subsecuencia de un polinucleótido de la presente invención. La presente también se refiere a una molécula de ARN bicatenario (ARNdc) inhibitorio, donde opcionalmente el ARNdc es una molécula de ARNip o miARN. 25

La presente invención también se refiere a métodos para degradar un material que contiene xilano mediante un polipéptido con actividad de acetilxilano esterasa.

La presente invención también se refiere a plantas que comprenden un polinucleótido aislado que codifica un 30 polipéptido con actividad de acetilxilano esterasa.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido con acetilxilano esterasa, que comprende: (a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido con actividad de acetilxilano esterasa, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) 35 recuperar del polipéptido.

La presente invención además se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden un gen que codifica una proteína, donde el gen está operativamente enlazado a una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal que comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 19 de la SEQ ID nº : 2, donde el gen es extranjero a la secuencia de 40 nucleótidos.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A y 1B muestran la secuencia de ADN genómico y la secuencia deducida de aminoácidos de una acetilxilano esterasa de Humicola insolens DSM 1800 CE1 (SEC ID NOs: 1 y 2, respectivamente) . Las secuencias intrónicas predichas se subrayan en negrita.

La Figura 2 muestra un mapa de restricción de pMMar6. 50

La Figura 3 muestra un mapa de restricción de pHinsAXE2.

Definiciones

Actividad de acetilxilano esterasa: el término "actividad de acetilxilano esterasa" se define en este documento 55 como una actividad de carboxilesterasa (EC 3.1.1.72) que cataliza la hidrólisis de grupos acetilo de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, alfa-naftil acetato y p-nitrofenil acetato. Para los propósitos de la presente invención, la actividad de acetilxilano esterasa se determina según el procedimiento descrito en los ejemplos de este documento. Una unidad de actividad de acetilxilano esterasa se define como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 μmol de anión p-nitrofenolato por... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado con actividad de acetilxilano esterasa, seleccionado del grupo que consiste en:

un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 85% de identidad con el polipéptido 5 maduro de la SEQ ID nº : 2;

un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida al menos bajo condiciones de astringencia altas con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID nº : 1, (ii) la secuencia de ADNc contenida en la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID nº : 1, o (iii) una cadena complementaria entera de (i) o (ii) ;

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 10 85% de identidad con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID nº : 1.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº : 2; o un fragmento de la misma que tiene actividad de acetilxilano esterasa.

3. Polipéptido según la reivindicación 1, que es codificado por un polinucleótido que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID nº : 1; o una subsecuencia de la misma que codifica un fragmento con actividad de acetilxilano esterasa.

4. Polipéptido según la reivindicación 1, que es codificado por el polinucleótido contenido en plásmido pHinsAXE2 el 20 cual está contenido en E. coli NRRL B-50076.

5. Polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Constructo de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido según la reivindicación 5 operativamente enlazado a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión.

7. Célula huésped no-humana recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 6.

8. Método para producir el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende: (a) cultivar una célula huésped según la reivindicación 7 que comprende un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

9. Método para producir un mutante de una célula madre, que comprende interrumpir o delecionar una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, lo que provoca que el mutante produzca menos polipéptido que la célula madre.

10. Método para producir el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende: (a) cultivar una 40 planta o una célula vegetal, que es transgénica para un polinucleótido que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

11. Planta, parte de planta o célula vegetal transgénica transformada con un polinucleótido que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 45

12. Molécula de ARN bicatenario (ARNdc) inhibitorio que comprende una subsecuencia del polinucleótido según la reivindicación 5.

13. Molécula de ARN bicatenario (ARNdc) inhibitorio que comprende una subsecuencia del polinucleótido según la 50 reivindicación 12, donde el ARNdc es una molécula de ARNip o miARN.

14. Método para inhibir la expresión de un polipéptido con actividad de acetilxilano esterasa en una célula, que comprende administrar a la célula o expresar en la célula una molécula de ARN bicatenario (ARNdc) , donde el ARNdc comprende una subsecuencia del polinucleótido según la reivindicación 5. 55

15. Constructo de ácidos nucleicos que comprende un gen que codifica una proteína operativamente enlazada a una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal que comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 19 de la SEQ ID nº : 2, donde el gen es extranjero a la secuencia de nucleótidos.

16. Célula huésped no-humana recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 15.

17. Método para producir una proteína, que comprende: (a) cultivar la célula huésped recombinante según la reivindicación 16 bajo condiciones propicias para la producción de la proteína; y (b) recuperar la proteína. 65

18. Método para degradar un material que contiene xilano, que comprende tratar el material que contiene xilano con el polipéptido con actividad de acetilxilano esterasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

19. Método según la reivindicación 18, que comprende además tratar el material que contiene xilano con una enzima degradadora de xilano. 5