Polimerasas libres de detergente.

Mezcla de reacción libre de cualquier detergente que comprende una formulación de una ADN polimerasa termoestable que está completamente libre de detergentes,

que comprende Tris/HCl 10 a 50 mM, EDTA 0,05-0,2 mM, DTT 0,5-2 mM, cloruro de potasio 50-200 mM y glicerol al 20-80 %,

- un ácido nucleico de molde, que preferentemente es un ADN,

- al menos un cebador que es un oligonucleótido que se puede unir a dicho ADN, y

- 4 dNTP,

que comprende adicionalmente al menos un par de sondas de hibridación de FRET.

Polimerasas libres de detergente

La presente invención se refiere al campo técnico de la preparación y aplicación de ADN polimerasas termoestables. De forma más precisa, la presente invención se refiere a proporciona un nuevo procedimiento para la producción y el uso de ADN polimerasas termoestables sin ninguna adición de detergente durante su producción, almacenamiento o durante la aplicación de la enzima.

Antecedentes de la invención

Las ADN polimerasas termoestables son enzimas que se han aislado y expresado de forma recombinante durante mucho tiempo desde el establecimiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Sin embargo, como es el caso para otras reacciones enzimáticas, se sabe que también el rendimiento de la PCR está obstaculizado al menos en parte por la presencia de cantidades mínimas de varios reactivos diferentes, tales como detergentes. Por otra parte, se sabe que la presencia de detergentes es esencial para muchos protocolos de purificación de las polimerasas y para la estabilización a largo plazo de enzimas en general y de las ADN polimerasas en particular.

Lawyer, F.C. et al. (JBC 264 (1989) 6427-6434) divulgan por primera vez la clonación y la expresión recombinante de Taq ADN polimerasa. De forma similar, el documento US 5.127.155 divulga formulaciones de polimerasas que se estabilizan con detergentes iónicos que son particularmente útiles para aplicaciones de PCR. Los detergentes estabilizantes usados como detergentes son Tritón X100, Tween 20 y Nonidet P-40.

Además, de acuerdo con las observaciones de los inventores del documento US 5.127.155, la presencia de detergentes dentro de las formulaciones divulgadas no se requiere sólo para mantener la estabilidad enzimática, sino también para potenciar la actividad de la polimerasa.

Se han divulgado procedimientos y formulaciones de purificación alternativos. Por ejemplo, el documento WO 08/077017 divulga formulaciones de polimerasas con detergentes e iónicos dipolares en lugar de detergentes no iónicos.

Lawyer et al. (PCR Methods and Applications, Coid Spring Harbor, p. 275-287 (1993)) proporcionan una mejora en los protocolos, en los que se reduce la presencia de detergentes durante la purificación de la enzima. Engelke, D.R. et al. (Anal. Biochem. 191 (1990) 396-400) divulgan formulaciones de Taq polimerasa recombinante sólo con cantidades mínimas de detergente, debido a que el tampón de almacenamiento añadido finalmente está libre de compuestos de detergente.

En vista de la técnica anterior expuesta, era un objetivo de la presente invención proporcionar una mejora en la formulación de polimerasas con un rendimiento optimizado en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Sumario de la invención

Por tanto, la presente invención se basa en una formulación de una ADN polimerasa termoestable que está completamente libre de detergentes. Se puede obtener una formulación de este tipo, si el procedimiento de purificación seleccionado no requiere la adición de un detergente en ninguna etapa de purificación.

La presente invención se refiere al uso de las formulaciones de polimerasas como de divulga anteriormente. Dichas formulaciones son predominantemente ventajosas, cuando se usan para la amplificación de un ácido nucleico diana por medio de PCR en tiempo real, en la que se detecta el producto de amplificación por al menos un par de sondas de hibridación de FRET.

La presente invención se basa en un procedimiento para la preparación de ADN polimerasas termoestables, en el que todas las etapas de la preparación se ejecutan en ausencia de cualquier detergente.

Por ejemplo, un procedimiento de este tipo puede comprender las siguientes etapas:

a) proporcionar un lisado complementado con inhibidores de proteasas,

b) precipitación de sulfato de amonio

c) una primera separación cromatográfica usando una primera matriz de cromatografía de afinidad

d) una segunda separación cromatográfica usando una segunda matriz de cromatografía de afinidad

e) una tercera separación cromatográfica usando una matriz de hidroxiapatita.

De forma alternativa, un procedimiento de este tipo puede requerir que la ADN polimerasa termoestable se exprese de forma recombinante en forma de una proteína de fusión que comprende una marca His. Entonces, la preparación comprende la etapa de purificar dicha proteína de fusión usando una columna de afinidad iónica cargada con níquel.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se origina a partir de la hipótesis teórica de que parte de la actividad enzimática de las cantidades mínimas de los detergentes podría afectar de algún modo al rendimiento de las ADN polimerasas termoestables bajo al menos algunas condiciones específicas. Como se mostrará en los ejemplos, en realidad se pudo probar que la hipótesis es cierta.

Formulaciones enzimáticas

Por lo tanto, la presente invención se basa en una formulación de una ADN polimerasa termoestable que está completamente libre de detergentes. En el contexto de la presente invención, el término "formulación de una ADN polimerasa termoestable" se entiende como cualquier preparación de una ADN polimerasa termoestable purificada al menos parcialmente, que se ha aislado a partir de un lisado celular. El lisado se puede obtener a partir de organismos que contienen de forma natural dicha ADN polimerasa termoestable, o preferentemente de células huésped modificadas de forma recombinante, que expresan el gen que codifica dicha ADN polimerasa termoestable.

Las ADN polimerasas termoestables son enzimas termoestables que originalmente se han aislado y clonado a partir de bacterias termófilas. Estas enzimas catalizan la extensión del cebador dependiente del molde por medio de la creación de un enlace fosfodiéster entre el grupo OH 3 libre de dicho cebador y el resto alfa-fosfato de un desoxinucleótido, mientras que se genera de forma simultánea pirofosfato como producto secundario. Preferentemente, dicho molde es un molde de ADN. De forma alternativa, el molde puede ser ARN.

El ejemplo más destacado de una ADN polimerasa dependiente de ADN termoestable es la Taq ADN polimerasa que se origina de Thermos aquaticus. Posee dos actividades enzimáticas: una actividad 5-3 polimerasa y una actividad 5-3 exonucleasa específica bicatenaria, que proporciona la enzima con capacidad de desplazamiento de hebra.

Se pueden formular una gran variedad de ADN polimerasas termoestables de acuerdo con la presente invención. Preferentemente, la ADN polimerasa termoestable se selecciona de un grupo que consiste en Aeropyrum pernix, Archaeoglobus fulgidus, Desulfurococcus sp. Tok., Methanobacterium thermoautotrophicum, Methanococcus sp. (por ejemplo, jannaschii, voltae), Methanothermus fervidus., especies Pyrococcus (furiosus, especie GB-D, woesii, abysii, horikoshii, KOD), Pyrodictium abyssii, Pyrodictium occultum, Sulfolobus sp. (por ejemplo, acidocaldarius, solfataricus), especies Thermococcus (zilligii, barossii, fumicolans, gorgonarius, JDF-3, kodakaraensis KODI, litoralis, species 9 degrees North-7, species JDF-3, gorgonarius, TY), Thermoplasma acidophilum, Thermosipho africanus, Thermotoga sp. (por ejemplo, marítima, neapolitana), Methanobacterium thermoautotrophicum, especies Thermus (por ejemplo, aquaticus, brockianus, filiformis, flavus, lacteus, rubens, ruber, thermophilus, Z05).

En un modo de realización, la ADN polimerasa termoestable es una polimerasa dependiente del molde de ADN. En otro modo de realización, la ADN polimerasa termoestable tiene una actividad de transcriptasa inversa adicional y se puede usar para RT-PCR. Un ejemplo para dicha enzima es Tth ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Roche Diagnostics, N.° Cat. 11 480 014 001).

Muchas ADN polimerasas dependientes de ADN termoestables, tales como Taq ADN polimerasa, carecen de actividad 3-5 exonucleasa dependiente bicatenaria, lo que también se conoce como actividad de corrección de errores. El alcance de la presente invención aún incluye además otras enzimas termoestables que poseen una actividad de corrección de errores de este tipo, tales como Pwo polimerasa (Roche Applied Science, N.° Cat. 04 743 750 001), Tgo polimerasa y Pfu polimerasa.

Además, dentro del alcance de la presente invención están mutantes, variantes o derivados de las mismas, quiméricas o "polimerasas de fusión" por ejemplo, Phuslon (Finnzymes o New England Biolabs, N.° Cat. F-530S) o iProof (Biorad, N.° Cat. 172-5300), Pfx Ultima (Invitrogen, N.° Cat. 12355012) o Herculase II Fusión (Stratagene, N.° Cat. 600675). Además, las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden comprender combinaciones de una o más de... [Seguir leyendo]

1. Mezcla de reacción libre de cualquier detergente que comprende una formulación de una ADN pollmerasa termoestable que está completamente libre de detergentes, que comprende Trls/HC110 a 50 mM, EDTA 0,05-0,2

mM, DTT 0,5-2 mM, cloruro de potasio 50-200 mM y glicerol al 20-80 %,

- un ácido nucleico de molde, que preferentemente es un ADN,

- al menos un cebador que es un oligonucleótldo que se puede unir a dicho ADN, y

- 4 dNTP,

que comprende adlclonalmente al menos un par de sondas de hibridación de FRET.

2. Uso de una mezcla de reacción de acuerdo con la reivindicación 1, para la amplificación de un ácido nucleico diana por medio de una PCR, en el que la PCR se monitoriza en tiempo real.