Plásmido pSAD para ensayos funcionales de splicing.

Plásmido pSAD para ensayos funcionales de splicing.

La presente invención se refiere a un vector génico útil para ensayos funcionales de splicing obtenido a partir del plásmido pSPL3b,

que comprende: una deleción del intrón de pSPL3b; una sustitución del MCS de pSPL3b por un casete lacZ sin sitio críptico aceptor de splicing; una mutación de fortalecimiento del sitio aceptor de splicing de pSPL3b; una mutación de inhabilitación de al menos una diana de restricción de pSPL3b; y consiste preferentemente en SEQ ID No: 79. Es asimismo objeto de la invención, un procedimiento de obtención del vector anterior.

La invención también se refiere a un minigen que comprende dicho vector con una secuencia nucleotídica clonada en el MCS de lacZ, así como una célula que comprende un vector o minigen de los anteriores. Además, también hace referencia al uso del vector o minigen en ensayos funcionales de splicing, protegiendo también un método para este tipo de ensayos.

PLïSMIDO pSAD PARA ENSAYOS FUNCIONALES DE SPLICING

Sector de la tïcnica La presente invenciïn se encuadra dentro del campo de la Biologïa Molecular y Biomedicina. En concreto, la presente invenciïn se refiere a vectores plasmïdicos para la realizaciïn de ensayos funcionales de splicing, que son de utilidad para la identificaciïn de mutaciones deletïreas de splicing en genes de predisposiciïn causantes de enfermedad, pudiendo servir como herramienta para el diagnïstico molecular de cïncer familiar y, en general, de todas las enfermedades hereditarias, y para el conocimiento bïsico de los mecanismos reguladores de esta etapa esencial de la expresiïn gïnica.

Estado de la tïcnica anterior

El procesamiento del pre-ARNm o “splicing” es una etapa esencial en la expresiïn de los genes eucariotas, en el cual se eliminan los intrones y se unen secuencialmente los exones (codificantes para proteïna) . De los aproximadamente 20.000 genes del genoma humano, alrededor del 90% de los trïnscritos primarios presentan splicing alternativo dando lugar a mïltiples isoformas proteicas (Kalsotra and Cooper, 2011) . El splicing 15 alternativo es un mecanismo crucial para el control de la expresiïn gïnica y la generaciïn de diversidad en el proteoma. Por ello, su regulaciïn es extraordinariamente precisa determinando cuïndo y dïnde se produce una isoforma determinada. La simple regla general [“sitio donador (GU) -punto de ramificaciïn (A) -tracto de pirimidinas-sitio aceptor (AG) ”] no basta para explicar una regulaciïn tan especïfica del splicing alternativo. Este proceso estï controlado por una serie de complejos ribonucleoproteicos, factores de splicing y otras secuencias 20 exïnicas e intrïnicas en cis denominadas enhancers y silenciadores de splicing (Cartegni et al., 2002) . A estos motivos se unen factores de splicing especïficos (bïsicamente proteïnas SR–enhancers y hnRNP–silenciadores) . Los enhancers fomentan la inclusiïn del exïn en el ARNm maduro mediante el reclutamiento de la maquinaria de splicing, mientras que los silenciadores reprimen la inclusiïn del exïn. Las proteïnas hnRNPs y SR son factores esenciales para el splicing constitutivo y alternativo especïfico de tejido. Cualquier mutaciïn que afecte a cualquiera de las secuencias reguladoras mencionadas puede afectar el splicing y estar asociada a una enfermedad.

Por otro lado, en las enfermedades hereditarias generalmente se consideran mutaciones causantes de enfermedad aquïllas que afectan a la proteïna, ya sea truncïndola (mutaciones nonsense y frameshift) o alterando su funciïn (mutaciones de cambio de amino ïcido o missense) , o aquïllas que alteran el 30 procesamiento del ARNm o splicing. Recientemente ha tomado especial relevancia en Biomedicina la correlaciïn entre splicing aberrante y enfermedad como consecuencia de la lista creciente de mutaciones patogïnicas ligadas a un splicing defectuoso de genes responsables de enfermedades hereditarias (Wang and Cooper, 2007) . Un anïlisis bioinformïtico, estimaba que aproximadamente un 60% de las mutaciones potencialmente deletïreas podrïa afectar el mecanismo de splicing (Lopez-Bigas et al., 2005) . Ademïs de las mutaciones 35 clïsicas que afectan a los sitios donador y aceptor, cabe seïalar que la eliminaciïn o alteraciïn de enhancers y silenciadores puede afectar el proceso de splicing. Por ello, cualquier variante de ADN, considerada a priori como un mero polimorfismo (p.e. variantes sinïnimas) , debe ser revisada por un posible efecto deletïreo a travïs del procesamiento del pre-ARNm. Precisamente, uno de los grandes problemas en la realizaciïn del Consejo Genïtico en enfermedades hereditarias es la detecciïn en los pacientes de variantes de ADN de efecto clïnico 40 desconocido (UVs) cuya implicaciïn en la enfermedad es desconocida. De hecho una gran fracciïn de las variantes detectadas en el rastreo de un gen de predisposiciïn son de este tipo (hasta un 15% de las pacientes con cïncer de mama/ovario son portadoras de UVs) , siendo necesaria su clasificaciïn como meros polimorfismos o mutaciones patogïnicas de cara a la activaciïn de los protocolos de prevenciïn y/o al establecimiento de terapias paliativas y/o curativas. Para estudiar el efecto de un cambio en el ADN sobre el 45 splicing y su implicaciïn en una enfermedad es necesario estudiar el ARN del paciente, que en muchas ocasiones no estï disponible para el laboratorio de diagnïstico molecular. Es aquï donde entran en juego los plïsmidos o vectores de exon trapping como el propuesto en esta patente. Estos vectores disponen de un “minigen” compuesto por un promotor eucariota, dos exones constitutivos y un intrïn. Se clona el exïn en estudio y las secuencias intrïnicas flanqueantes dentro del intrïn del vector en la orientaciïn adecuada: “exïn 1 vector – 50 [intrïn – sitio aceptor – exïn en estudio – sitio donador – intrïn] – exïn 2 vector”. Al introducir esta construcciïn, a la que llamamos minigen hïbrido (plïsmido reportero de splicing o splicing reporter minigenes) , en cïlulas eucariotas humanas en cultivo (por ejemplo, cïlulas HeLa) , se produce una reacciïn heterïloga de splicing entre los exones del vector y el exïn en estudio, produciïndose un trïnscrito que contiene los dos exones constitutivos del vector de splicing y el exïn clonado entre ambos. Para estudiar el efecto de cualquier mutaciïn detectada en 55 pacientes, bastarï con generarla mediante un sencillo protocolo de mutagïnesis dirigida sobre el minigen wild type, y ensayarla como se ha descrito arriba, de tal manera que estos plïsmidos reporteros de splicing permiten realizar ensayos funcionales de splicing sin necesidad de ARN del paciente. No sïlo eso, estos vectores son muy ïtiles para la investigaciïn bïsica de los mecanismos reguladores del splicing, identificaciïn de secuencias reguladoras y factores de splicing implicados en el procesamiento de cada exïn.

Sin embargo, los vectores para la construcciïn de minigenes son muy escasos. De hecho el mïs extendido es el plïsmido pSPL3 (Invitrogen) que estï descatalogado desde hace aïos. Este vector ha sido empleado en trabajos de investigaciïn de los inventores de la presente invenciïn (Acedo et al, 2012; Sanz et al, 2010) y presenta una serie de limitaciones. En primer lugar, su elevado tamaïo (6, 1 Kb) complica la clonaciïn de insertos largos con varios exones consecutivos, necesarios para el mantenimiento del “contexto genïmico” en las reacciones de splicing. En segundo lugar, la selecciïn de las colonias recombinantes es ardua y laboriosa porque todas las colonias (con inserto o no) son resistentes a Ampicilina, pero no existe un segundo mïtodo de selecciïn de los clones con inserto, por lo que forzosamente hay que rastrear todas las colonias obtenidas tras la transformaciïn, y el rendimiento (proporciïn de colonias recombinantes) suele ser muy bajo. En tercer lugar, se han descrito la presencia de sitios crïpticos de splicing y pseudoexones que pueden interferir en la reacciïn de splicing (Burn et al., 1995) .

Otro vector comercial es el pExontrap (Mobitec) , aunque ha sido poco utilizado en la bibliografïa. Sin embargo, segïn evidencias experimentales obtenidas por los autores de la presente invenciïn, las reacciones de RT-PCR producïan productos de splicing inespecïficos comparados con los obtenidos con el uso del plïsmido pSPL3, y

por consiguiente su uso no resulta siempre conveniente. Otro vector es el pSpliceExpress (no comercial y de uso poco extendido) derivado del pExontrap cuya clonaciïn estï basado en la recombinaciïn con la enzima Clonasa (Kishore et al, 2008) y, por tanto, no se emplean enzimas de restricciïn.

En consecuencia, existe la necesidad de disponer de nuevos vectores para la construcciïn de minigenes que permitan clonar fragmentos de DNA de mayor tamaïo o con un mayor nïmero de exones, y que a la vez minimicen los productos de splicing inespecïficos que pueden dar lugar a resultados errïneos. Ademïs, serïa conveniente que estos vectores dispusieran de un segundo sistema de selecciïn que permitiera identificar fïcilmente aquellos clones que contienen vectores con insertos de ADN en su secuencia.

Bibliografïa Acedo A, Sanz DJ, Durïn M, Infante M, Pïrez-Cabornero L, Miner C, Velasco EA (2012) Comprehensive splicing 25 functional analysis of DNA variants of the BRCA2 gene by hybrid minigenes. Breast Cancer Res 14:R87.

Burn TC, Connors TD, Klinger KW, Landes GM (1995) Increased exon-trapping efficiency through modifications to the pSPL3 splicing vector. Gene 161:183-187.

Cartegni L, Chew SL, Krainer AR (2002) Listening to silence and understanding nonsense: Exonic mutations that... [Seguir leyendo]

1. Vector gïnico ïtil para ensayos funcionales de splicing obtenido a partir del plïsmido pSPL3b SEQ ID No:1, caracterizado porque comprende:

a. una deleciïn de al menos 1, 2 kilobases del intrïn de SEQ ID No: 1;

b. una sustituciïn del sitio de clonaciïn mïltiple de SEQ ID No: 1 por un casete lacZ, donde dicho casete lacZ comprende una primera mutaciïn de eliminaciïn de un primer sitio crïptico aceptor de splicing;

c. una segunda mutaciïn de fortalecimiento de un segundo sitio aceptor de splicing, en al menos tres nucleïtidos comprendidos entre las posiciones 2835 y 2875 de SEQ ID No: 1;

d. al menos una tercera mutaciïn de inhabilitaciïn de al menos una diana de restricciïn comprendida entre

las posiciones 340 y 2623 de SEQ ID No: 1, y donde dicha mutaciïn comprende al menos una modificaciïn de un nucleïtido de la secuencia de la diana.

2. Vector gïnico segïn la reivindicaciïn 1, donde la deleciïn del intrïn comprende la eliminaciïn de los nucleïtidos comprendidos entre las posiciones 1299 y 2498 de SEQ ID No: 1.

3. Vector gïnico segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 ï 2, donde el casete lacZ es SEQ ID No: 2.

4. Vector gïnico segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la sustituciïn definida en b comprende una eliminaciïn de la secuencia comprendida entre las posiciones 1011 y 1118 de SEQ ID No: 1 con enzimas EcoRI y NdeI, y una inserciïn posterior del casete lacZ con extremos MunI y NdeI.

5. Vector gïnico segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la segunda mutaciïn comprende:

c.1. un primer cambio de Adenina por Timina en el nucleïtido en posiciïn 2846 de SEQ ID No: 1 20 (2846A>T) ,

c.2. un segundo cambio de Guanina por Timina en el nucleïtido en posiciïn 2849 de SEQ ID No: 1 (2849G>T) ,

c.3. un tercer cambio de Adenina por Guanina en el nucleïtido en posiciïn 2856 de SEQ ID No: 1 (2856A>G) .

6. Vector gïnico segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la tercera mutaciïn se selecciona entre:

d.1. una modificaciïn de al menos un nucleïtido en la secuencia de una primera diana HindIII comprendida entre las posiciones 340 y 345 de SEQ ID No: 1 y una modificaciïn de al menos un nucleïtido en la secuencia de una segunda diana HindIII comprendida entre las posiciones 2618 y 2623 de SEQ ID No: 1,

d.2. una modificaciïn de al menos un nucleïtido en la secuencia de una diana XbaI comprendida entre las posiciones 679 y 684 de SEQ ID No: 1,

d.3. una modificaciïn de al menos un nucleïtido en la secuencia de una diana SalI comprendida entre las posiciones 685 y 690 de SEQ ID No: 1,

y cualquier combinaciïn de las mismas.

7. Vector gïnico segïn la reivindicaciïn 6, donde la modificaciïn de la primera diana HindIII definida en d.1 consiste en un cambio de Guanina por Adenina en el nucleïtido en posiciïn 342 de SEQ ID No: 1 (342G>A) .

8. Vector gïnico segïn una cualquiera de las reivindicaciones 6 ï 7, donde la modificaciïn de la segunda diana

HindIII definida en d.1 consiste en un cambio de Guanina por Adenina en el nucleïtido en posiciïn 2620 de SEQ 40 ID No: 1 (2620G>A) .

9. Vector gïnico segïn una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde la modificaciïn definida en d.2 consiste en un cambio de Timina por Citosina en el nucleïtido en posiciïn 679 de SEQ ID No: 1 (679T>C) .

10. Vector gïnico segïn una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, donde la modificaciïn definida en d.3 consiste en un cambio de Guanina por Adenina en el nucleïtido en posiciïn 685 de SEQ ID No: 1 (685G>A) .

11. Vector gïnico segïn una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde la tercera mutaciïn comprende las modificaciones definidas en d.1.

12. Vector gïnico segïn una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde la tercera mutaciïn comprende las modificaciones definidas en d.1, d.2 y d.3.

13. Vector gïnico segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que consiste en SEQ ID No: 79.

14. Vector gïnico segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que se selecciona entre SEQ ID No: 3 ï SEQ ID No: 4.

15. Minigen ïtil para ensayos funcionales de splicing, caracterizado porque comprende un vector definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y al menos una secuencia de nucleïtidos clonada en el sitio de clonaciïn mïltiple del casete lacZ de dicho vector.

16. Minigen segïn la reivindicaciïn 15, donde la secuencia de nucleïtidos clonada, comprende al menos un exïn de un gen y las secuencias parciales o totales de nucleïtidos de los intrones que flanquean a dicho exïn en 15 el gen.

17. Minigen segïn la reivindicaciïn 16, donde el gen es un gen de predisposiciïn a una enfermedad.

18. Minigen segïn la reivindicaciïn 17, donde el gen de predisposiciïn a una enfermedad es un gen BRCA.

19. Minigen segïn la reivindicaciïn 18 que se selecciona entre SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ

ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID 20 No: 15, SEQ ID No: 16, SEQ ID No: 17 y SEQ ID No: 18.

20. Cïlula que comprende un vector gïnico definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o un minigen definido en una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19.

21. Cïlula segïn la reivindicaciïn 20, donde la cïlula es una bacteria.

22. Cïlula segïn la reivindicaciïn 21, donde la bacteria es una cepa de E. coli DH5α.

23. Cïlula segïn una cualquiera de las reivindicaciones 21 ï 22, que es una seleccionada entre CECT 8152 ï CECT 8153.

24. Procedimiento de obtenciïn de un vector gïnico definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque, a partir del plïsmido pSPL3b de secuencia SEQ ID No: 1, comprende las siguientes etapas:

A.1. reducir el tamaïo del plïsmido SEQ ID No: 1 mediante deleciïn de al menos 1, 2 kilobases del intrïn por una primera mutagïnesis dirigida con un primer par de cebadores especïficos para dicha deleciïn, donde la secuencia de un cebador comprende una secuencia de al menos 25 nucleïtidos consecutivos comprendidos entre las posiciones 1125 y 1394 de SEQ ID No: 1, unida por su extremo 3’ a una secuencia de al menos 25 nucleïtidos consecutivos comprendidos entre las posiciones 2349

y 2617 de SEQ ID No: 1, y la secuencia del otro cebador es la complementaria;

A.2. amplificar un casete lacZ con extremos MunI y NdeI mediante PCR con un segundo par de cebadores, donde uno de los cebadores comprende en su secuencia un sitio de restricciïn MunI, y otro cebador comprende en su secuencia un sitio de restricciïn NdeI;

A.3. eliminar el sitio de clonaciïn mïltiple del plïsmido SEQ ID No:1 mediante enzimas de restricciïn 40 EcoRI y NdeI, y clonar el casete lacZ amplificado en A.2;

A.4. eliminar un sitio crïptico aceptor fuerte de splicing del casete lacZ, mediante una segunda mutagïnesis dirigida con un tercer par de cebadores, donde uno de los cebadores comprende SEQ ID No: 87 y el otro cebador comprende SEQ ID No: 88;

A.5. fortalecer el sitio aceptor de splicing comprendido entre las posiciones 2835 y 2875 de SEQ ID No: 1 mediante una tercera mutagïnesis dirigida a las posiciones 2846, 2849 y 2856 con un cuarto par de cebadores, donde uno de los cebadores comprende SEQ ID No: 26, y el otro cebador comprende SEQ ID No: 27;

A.6. inhabilitar al menos una diana de restricciïn comprendida entre las posiciones 340 y 2623 de SEQ ID No: 1 mediante al menos una cuarta mutagïnesis dirigida a modificar un nucleïtido comprendido en la secuencia de dicha diana, con un quinto par de cebadores especïficos que comprendan en su secuencia la modificaciïn de dicho nucleïtido.

25. Procedimiento segïn la reivindicaciïn 24, donde se delecionan 1, 2 kilobases del intrïn mediante un cebador 10 que comprende SEQ ID No: 19 y un cebador que comprende SEQ ID No: 20.

26. Procedimiento segïn una cualquiera de las reivindicaciones 24 ï 25, donde el quinto par de cebadores para inhabilitar la diana de restricciïn se selecciona entre al menos uno de los siguientes:

A.6.1. un cebador que comprende SEQ ID No: 28 y un cebador que comprende SEQ ID No: 29, y ademïs un cebador que comprende SEQ ID No: 30 y un cebador que comprende SEQ ID No: 31,

A.6.2. un cebador que comprende SEQ ID No: 32 y un cebador que comprende SEQ ID No: 33.

27. Uso de un vector gïnico definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o de un minigen definido en una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, o de una cïlula definida en una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23 en ensayos funcionales de splicing.

28. Uso de un vector gïnico definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o de un minigen definido

en una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, o de una cïlula definida en una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, para detectar una mutaciïn en al menos un exïn y/o intrïn de un gen que produce un splicing defectuoso.

29. Mïtodo para ensayo funcional de splicing caracterizado porque, a partir de un vector gïnico definido en una de las reivindicaciones 1 a 14, comprende los siguientes pasos:

B.1. clonar al menos una secuencia de nucleïtidos que comprende al menos un exïn de un gen y sus secuencias intrïnicas flanqueantes, con la orientaciïn adecuada del sitio donador y aceptor de splicing, en el sitio de clonaciïn mïltiple de un vector definido en una de las reivindicaciones 1 a 14, para obtener un minigen wild-type;

B.2. transformar el minigen wild-type anterior en una cepa bacteriana;

B.3. cultivar la cepa bacteriana transformada en presencia de ampicilina, X-Gal e IPTG y seleccionar colonias blancas;

B.4. aislar el minigen wild-type de una colonia blanca seleccionada y generar un minigen mutante que comprenda una mutaciïn en el exïn o secuencias intrïnicas del gen, donde dicho minigen mutante se obtiene mediante mutagïnesis dirigida sobre el minigen wild-type aislado por PCR y polimerasa de alta fidelidad con cebadores especïficos que comprendan en su secuencia dicha mutaciïn;

B.5. transfectar el minigen mutante a una cïlula eucariota;

B.6. extraer el ARN producido en un cultivo de la cïlula eucariota transfectada,

B.7. sintetizar cDNA a partir del ARN extraïdo y realizar RT-PCR con cebadores especïficos de los exones constitutivos del vector;

B.8. secuenciar y analizar el cDNA sintetizado en el paso B.7.

OFICINA ESPAïOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.ï solicitud: 201231427

ESPAïA

Fecha de presentaciïn de la solicitud: 14.09.2012

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C12N15/85 (2006.01) C12Q1/68 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categorïa 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

Y DESVIAT, L.R. et al., ‘Minigenes to confirm exon skipping mutations’, METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Abr 2012, Vol. 867, Pïgina.

3. 47, ISSN: 1940-6029 (Electronic) , doi: 10.1007/978-1-61779-767-5_3, : Materiales; Mïtodos, Figuras 1 y 2. 1-29

Y BURN, T.C. et al., ’Increased exon-trapping efficiency through modifications to the pSPL3 splicing vector’, GENE, 1995, Vol.161, No. 2, Pïgina.

18. 187, ISSN: 0378-1119, Experimental y Discusiïn, Figuras 1 y 2. 1-29

Y DATSON, N.A. et al., ‘Specific isolation o.

3. terminal exons of human genes by exon trapping’, NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 1994, Vol. 22, No. 20, Pïginas 4148-4153, ISSN: 0305-1048, Materiales y Mïtodos, Figura 1. 1-29

Y DUYK, G.M. et al., ‘Exon trapping: a genetic screen to identify candidate transcribed sequences in cloned mammalian genomic DNA’, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE U S A., 1990, Vol. 87, No. 22, Pïginas 8995-8999, ISSN: 0027-8424 (Print) , Materiales y Mïtodos, Resultados, Figura 1 y 2. 1-29

A ACEDO, A. et al., ‘Comprehensive splicing functional analysis of DNA variants of the BRCA2 gene by hybrid minigenes’, BREAST CANCER RESEARCH, 2012 Mayo, Vol. 14, No. 3, Pïgina R87, ISSN: 1465-5411 (print) , ISSN: 1465-542X (electronic) , todo el documento. 1-29

A SANZ, D.J. et al., ‘A high proportion of DNA variants of BRCA1 and BRCA2 is associated with aberrant splicing in breast/ovarian cancer patients’, CLINICAL CANCER RESEARCH, 2010 Mar, Vol. 16, No. 6, Pïginas 1957-1967, ISSN: 1078-0432 (print) , todo el documento. 1-29

A BONNET, C. et al., ‘Screening BRCA1 and BRCA2 unclassified variants for splicing mutations using reverse transcription PCR on patient RNA and an ex vivo assay based on a splicing reporter minigene’, JOURNAL OF MEDICAL GENETICS, 2008, Vol. 45, No. 7, Pïgina.

43. 446, ISSN: 0022-2593 (print) , ISSN: 1468-6244 (electronic) , doi: 10.1136/jmg.2007.056895, todo el documento. 1-29

A GAILDRAT, P. et al., ‘Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants’, METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 2010, Vol. 653, Pïgina.

24. 257, ISSN: 1940-6029 (Electronic) , doi: 10.1007/978-1-60761-759-4_15, todo el documento. 1-29

Categorïa de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categorïa A: refleja el estado de la tïcnica O: referido a divulgaciïn no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaciïn de la solicitud E: documento anterior, pero publicado despuïs de la fecha de presentaciïn de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nï:

Fecha de realizaciïn del informe 10.06.2014 Examinador J. L. Vizïn Arroyo Pïgina 1/6

OFICINA ESPAïOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.ï solicitud: 201231427

ESPAïA

Fecha de presentaciïn de la solicitud: 14.09.2012

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C12N15/85 (2006.01) C12Q1/68 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categorïa 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

A US 2008095712 A1 (KUROYANAGI, H. et al.) 24.04.2008, todo el documento. 1-29

A GURSKAYA, N.G. et al, ‘Analysis of alternative splicing of cassette exons at single-cell level using two fluorescent proteins’, NUCLEIC ACIDS RES., 2012 Abr, Vol. 40, No. 8, Pïgina e57, ISSN: 0305-1048 (print) , ISSN: 1362-4962 (electronic) , doi: 10.1093/nar/gkr1314, todo el documento. 1-29

Categorïa de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categorïa A: refleja el estado de la tïcnica O: referido a divulgaciïn no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaciïn de la solicitud E: documento anterior, pero publicado despuïs de la fecha de presentaciïn de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nï:

Fecha de realizaciïn del informe 10.06.2014 Examinador J. L. Vizïn Arroyo Pïgina 2/6

INFORME DEL ESTADO DE LA TïCNICA

Nï de solicitud: 201231427

Documentaciïn mïnima buscada (sistema de clasificaciïn seguido de los sïmbolos de clasificaciïn) C12N, C12Q Bases de datos electrïnicas consultadas durante la bïsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, tïrminos de

bïsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, BIOSIS, MEDLINE, EMBASE, EMBL-EBI

Informe del Estado de la Tïcnica Pïgina 3/6

OPINIïN ESCRITA

Nï de solicitud: 201231427

Fecha de Realizaciïn de la Opiniïn Escrita: 10.06.2014

Declaraciïn

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Reivindicaciones Reivindicaciones 1-29 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Reivindicaciones Reivindicaciones 1-29 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicaciïn industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y tïcnico de la solicitud (Artïculo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opiniïn.

La presente opiniïn se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Tïcnica Pïgina 4/6

OPINIïN ESCRITA

Nï de solicitud: 201231427

1. Documentos considerados.

A continuaciïn se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la tïcnica tomados en consideraciïn para la realizaciïn de esta opiniïn.

Documento Nïmero Publicaciïn o Identificaciïn Fecha Publicaciïn

D01 DESVIAT, L.R. et al., Methods Mol. Biol., (2012 Abr) , 867.

3. 47. 2012 Abr

D02 BURN, T.C. et al., Gene, (1995) , 161 (2) .

18. 7. 1995

D03 DATSON, N.A. et al., Nucleic Acids Res., (1994) , 22 (20) : 4148-4153. 1994

D04 DUYK, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., (1990) , 87 (22) : 8995-9. 1990

D05 ACEDO, A. et al., Breast Cancer Res., (2012 Mayo) , 14 (3) :R87. 2012 Mayo

D06 SANZ, D.J. et al., Clin. Cancer Res., (2010 Mar) , 16 (6) : 1957-67. 2010

D07 BONNET, C. et al., J. Med. Genet., (2008) , 45 (7) .

43. 46. 2008

D08 GAILDRAT, P. et al., Methods Mol. Biol., (2010) , 653:249-57. 2010

D09 US 2008095712 A1 (KUROYANAGI, H. et al.) 24.04.2008

D10 GURSKAYA, N.G. et al, Nucleic Acids Res., (2012 Abr) , 40 (8) : e57. 2012 Abr

En D1-D10 se divulgan diferentes plïsmidos o vectores ïtiles para la identificaciïn de exones potenciales (‘exon trapping vector’) .

2. Declaraciïn motivada segïn los artïculos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecuciïn de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraciïn 1. NOVEDAD (Art. 4.1. y Art. 6.1. de la Ley de Patentes) .

1.1 Reivindicaciones independientes 1, 24 y 29.

1.1.1. El objeto de la reivindicaciïn 1 consiste en un vector gïnico, derivado del plïsmido pSPL3b (SEQ ID No:1) , ïtil para ensayos funcionales del procesamiento del pre-ARNm (‘splicing’) caracterizado porque comprende las siguientes modificaciones en la secuencia de pSPL3b: (a) una deleciïn de al menos 1, 2 Kb en el intrïn de pSPL3b, (b) la sustituciïn del sitio de clonaciïn multiple (MCS) de pSPL3b por un casete lacZ que comprende una mutaciïn de eliminaciïn de un primer sitio crïptico aceptor de ‘splicing’, (c) una mutaciïn de fortalecimiento de un segundo sitio aceptor de ‘splicing’ y (d) al menos una mutaciïn de inhabilitaciïn de un sitio de restricciïn. Las reivindicaciones 24 y 29 tratan de un procedimiento de obtenciïn del vector gïnico de la reivindicaciïn 1 y de un procedimiento para el ensayo funcional de ‘splicing’ basado en el uso del vector de la reivindicaciïn 1.

En el estado de la tïcnica se ha divulgado el uso de vectores gïnicos para ensayos funcionales de ‘splicing’ (cf: D01-D10) . Sin embargo, ninguno de tales vectores comparte las caracterïsticas tïcnicas del reivindicado en la solicitud de patente.

Por consiguiente, el objeto de protecciïn de las reivindicaciones independientes 1, 24 y 29, y el de las dependientes 2-23.

2. 28 se considera que es nuevo sobre la base de los documentos D01-D10.

1.2. La presente solicitud satisface el criterio establecido en el Art. 4.1. de la Ley de Patentes, pues el objeto de las reivindicaciones 1-29 es nuevo de acuerdo con el Art. 6.1. de la Ley de Patentes.

2. ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 4.1. y Art. 8.1. de la Ley de Patentes) .

2.1. Reivindicaciones independientes 1, 24 y 29.

2.1.1. Los documentos D01-D04 constituyen el estado de la tïcnica mïs prïximo. En D01-D02 se divulga el uso de minigenes (vector pSPL3) en ensayos funcionales de ‘splicing’ y el plïsmido pSPL3b derivado de pSPL3. En D03-D04 se describe un vector para la clonaciïn e identificaciïn de exones que comprende el exïn 1 de º-globina humana, el gen lacZa y un sitio de clonaciïn mïltiple (MSC) (cf. D01: Materiales; Mïtodos, Figuras 1 y 2. D02: Experimental y Discusiïn, Figuras 1 y 2. D03: Materiales y Mïtodos, Figura 1. D04: Materiales y Mïtodos, Resultados, Figura 1 y 2) .

2.1.2. El problema tïcnico a resolver por el objeto de la reivindicaciïn 1 puede ser considerado, por consiguiente, como la provisiïn de nuevos vectores ïtiles para ensayos funcionales de ‘splicing’ que permitan clonar fragmentos de ADN de mayor tamaïo, minimizar los productos de ‘splicing’ inespecïficos e identificar mïs fïcilmente los clones que contienen un inserto de ADN (cf. Pïgina 3, lïneas 18-22) .

Informe del Estado de la Tïcnica Pïgina 5/6

OPINIïN ESCRITA

Nï de solicitud: 201231427

2.1.3. La soluciïn propuesta en la reivindicaciïn 1 consiste en un vector derivado del plïsmido pSPL3b (cf. D02) caracterizado bïsicamente por sustituir el MSC original del intrïn de pSPL3b por un casete lacZ constituido por el gen LacZa (SEQ ID No: 2) o por LacZa y un MSC (SEQ ID No: 21) , y por reducir el tamaïo del intrïn de pSPL3b mediante una deleciïn de al menos 1, 2 Kb. Ademïs, se introducen cambios puntuales en la secuencia del intrïn que conllevan la inhabilitaciïn de sitios de restricciïn, asï como, la eliminaciïn o el fortalecimiento de sitios aceptores de ‘splicing’. Segïn la descripciïn, la introducciïn del casete LacZ en los vectores reivindicados mejora la capacidad de selecciïn de los clones recombinantes portadores de un vector con un fragmento de ADN insertado en el casete LacZ, pues estos clones son de color blanco en presencia de X-Gal e IPTG frente al color azul de los clones no recombinantes. Por otro lado, la deleciïn de al menos 1, 2 Kb de pSPL3b permite la clonaciïn de insertos de mayor tamaïo y los cambios puntuales que afectan a sitios de restricciïn y a sitios aceptores de ‘splicing’ generan sitios ïnicos de clonaciïn y minimizan la apariciïn de los productos de ‘splicing’ inespecïficos (cf. Pïgina 8, lïneas 15-30) . En D02 se describe el plïsmido pSPL3b derivado de pSPL3 que comprende unas modificaciones en su secuencia que minimizan los productos de ‘splicing’ inespecïficos del primero (cf D02: ‘Experimental and Discussion’, Figuras 1 y 2) . En los documentos D03-D04 se divulga un vector gïnico para la clonaciïn de exones que comprende un ïnico sitio donador de ‘splicing’, seguido del gen lacZa y de un MSC. Este vector permite identificar exones internos y/o externos insertados en el MSC, mediante la selecciïn de colonias blancas en presencia de X-Gal e IPTG (cf. D03: Materiales y Mïtodos, Figura 1. D04: Materiales y Mïtodos, Resultados, Figuras 1 y 2) . En cuanto a la reducciïn del tamaïo de un vector mediante la deleciïn de un fragmento del mismo para favorecer la clonaciïn de fragmentos de mayor tamaïo es una tïcnica ampliamente descrita y utilizada en el estado de la tïcnica.

Por consiguiente, ante el problema tïcnico planteado, el experto en la materia combinarïa los conocimientos divulgados en D01-D02 y D03-D04 que, junto a los de D05-D10, le llevarïan a la soluciïn propuesta en la reivindicaciïn 1 o a una equivalente. Por todo ello, se considera que la reivindicaciïn 1 y las reivindicaciones dependiente 2-23, 27 y 28 no son inventivas. Anïlogamente, las reivindicaciones independientes 24 y 29 que tratan del procedimiento de obtenciïn del vector de la invenciïn y de un procedimiento para el ensayo funcional de ‘splicing’ basado en el uso del mismo y sus reivindicaciones dependiente.

2. 26, se consideran no inventivas sobre la base de los documentos D01-D10.

2.2. La presente invenciïn no satisface el criterio establecido en el Art. 4.1. de la Ley de Patentes porque el objeto de la invenciïn, definido en las reivindicaciones 1-29 no implica actividad inventiva de acuerdo con el Art. 8.1. de la Ley de Patentes.

Informe del Estado de la Tïcnica Pïgina 6/6