Péptidos RumC que presentan una actividad antimicrobiana.

Péptido que tiene una actividad antimicrobiana contra las cepas de Clostridium perfringens,

caracterizado porque comprende un péptido seleccionado de entre los péptidos siguientes:

- el péptido de la secuencia SEC ID nº 1,

- un péptido que comprende un péptido que presenta por lo menos el 80% de identidad con el polipéptido de la SEC ID nº 1,

- el péptido de la secuencia SEC ID nº 2,

- un péptido que comprende un péptido que presenta por lo menos el 80% de identidad con el polipéptido de la SEC ID nº 2

Péptidos RumC que presentan una actividad antimicrobiana.

La invención se refiere a los péptidos RumC1, RumC2 y RumC3 que presentan una actividad antimicrobiana, así como a los genes que codifican para estos péptidos y aislados de Ruminococcus gnavus E1.

Algunas cepas bacterianas tienen la capacidad de liberar unas sustancias que tienen un efecto bacterioestático o bactericida sobre sus competidores. Estas sustancias antimicrobianas pueden ser de naturaleza orgánica, por ejemplo ácidos orgánicos o peróxido de hidrógeno (Ross et al., Int. J. Food Microbiol. 79, 3-16, 2002) , o de naturaleza peptídica. Se distinguen, además, los péptidos antimicrobianos sintetizados por vía enzimática que forman las clase de los antibióticos (Mootz et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 543-551, 1997; Keating et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 598-606, 1999) , y los péptidos producidos por la vía ribosómica que forman la clase de las bacteriocinas (Jacob et al., Ann. Inst. Pasteur (París) 84, 222-224, 1953) .

Las bacteriocinas suscitan un interes creciente en el mundo de la investigacion y de la industria; podria proporcionar soluciones alternativas a la utilización de antibióticos, en particular en la crianza (Luchansky, Antonie Van Leeuwenhoek 76, 335, 1999; O'Sullivan et al., Biochimie 84, 593-604, 2002) .

Numerosos sistemas de expresión heterólogos de estas bacteriocinas se han desarrollado hace algunos años. En particular, Morisset et al. (Morisset et al., Appl. Environ. Microbiol., 70, 4672-4680, 2004) han expresado unas variantes de la mesentricina Y105, bacteriocina de clase IIa producida por Leuconostoc mesenteroides sub. esp. mensenteroides Y105, en Leuconostoc mesenteroides sub. esp. dextranicum DSM20484. Asimismo, Flynn et al. (Microbiol., 148, 973-984, 2002) han realizado la expresión de ABP-118, bacteriocina de clase llb producida originalmente por Lactobacillus salivarius sub. esp. salivarius UCC118, en los hospedantes Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis y Bacillus cereus.

Además, se realizaron varios ensayos para expresar unas bacteriocinas en la bacteria Escherichia coli (McCormick et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 4757-4766, 1998; Garneau et al., Appl. Environ. Microbiol., 69, 1352-1358, 2003; Biet et al., Microbiol., 144, 2845-2854, 1998; Miller et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 14-20, 1998; Richard et al., J. Bacteriol., 186, 4276-4284, 2004; Kloche et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 67:532-538, 2005) , la levadura Saccharomyces cerevisiae (Schoeman et al., Yeast, 15, 647-656, 1999; Van Reenen et al., Int. J. Food Microbiol., 81, 29-40, 2003) y en unas bacterias lácticas (Rodriguez et al., Int. J. Food Microbiol., 80, 101-116, 2003) .

Por lo tanto, se realizaron numerosos trabajos para la identificación de nuevas bacteriocinas y para la producción de estas bacteriocinas.

El ecosistema digestivo está constituido por una microflora abundante y muy compleja que agrupa unas bacterias, unas levaduras y unos Archeae. Esta microbiota es esencialmente anaeróbica y se encuentran principalmente las bacterias de los géneros Bacteroides, Eubacterium, Clostridium, Ruminococcus, Bifidobacterium y Fusobacterium (Suau et al., Appl. Environ. Microbiol. 65, 4799-4807, 1999) . La microflora tiene un impacto importante sobre la salud del hospedante. Está en particular implicada en la toxificación y la destoxificación de compuestos metabólicos procedentes de la alimentación (Hughes y Rowland Microbial Ecology Health Disease 2, 179-185, 2000) . Es asimismo capaz de modular la expresión de funciones enterocitarias (Br y et al., Science 273, 1380-1383, 1996; Hooper et al., Science 291, 881-884, 2001) . Por último, desempeña un papel primordial en la protección del hospedante contra la invasión por bacterias exógenas potencialmente patógenas (Ducluzeau et al., Microbial Ecology and Intestinal Infections, 1988; Fons et al., Microbial Ecology in Health and Disease 2, 240-246, 2000) .

Entre los patógenos intestinales conocidos, se encuentra Clostridium perfringens, bacteria Gram positiva, anaerobia estricta, capaz de esporular y muy extendida en el ambiente. Este patógeno puede proceder de la alimentación, pero puede estar también presente en baja concentración en el intestino y comenzar a proliferarse y a segregar unas toxinas bajo el efecto de una tensión. Las cepas de Clostridium perfringens están clasificadas en 5 toxinotipos en función de las toxinas que producen (Petit et al., Trends Microbiol. 7, 104-110, 1999) . Las cepas de C. perfringens de tipo A son responsables de enfermedades gastrointestinales en el ser humano. En 1997, ses registraron en los Estados Unidos más de 245000 casos de infecciones con C. perfringens. Esto condujo a la hospitalización de 41 personas, de las cuales 7 no han sobrevivido (Mead et al., Emerg. Infect. Dis. 5, 607-625, 1999) . Las cepas de C. perfingens de tipo A y C pueden ser, respectivamente, el origen de enteritis necrótica en las aves de corral y los cerdos. En las aves de corral, la enteritis necrótica es una patología aguda, de evolución rápida cuya mortalidad puede alcanzar del 1 al 2% por día. Además de su incidencia sobre el bienestar de los animales, esta patología puede por lo tanto tener una influencia económica nada despreciable. Hasta 1999, esta enfermedad era bien controlada mediante el uso de antibióticos como factores de crecimiento. Pero la unión Europea ha prohibido su uso en la alimentación animal por temor a seleccionar bacterias resistentes y por lo tanto ver disminuir la eficacia de los antibióticos en el ser humano. A partir de esta prohibición, la enteritis necrótica provocada por Clostridium perfingens en las aves de corral y en cerdos ya no está controlada en Europa. El número de casos declarados en la Red Nacional de Observaciones Epidemiológicas en Avicultura (RNOEA) (AFSSA Ploufragan) aumentó considerablemente en 1999 y 2000 (Valancony, Bulletin des GTV 12, 9-12, 2001) .

En la actualidad, la búsqueda de soluciones alternativas para controlar y tratar esta enfermedad es por lo tanto de principal importancia.

Ruminococcus gnavus es una bacteria anaeróbica estricta que pertenece a la familia de las Lachnospiraceae, del orden de los Clostridiales. Dabard et al. (Appl. Environ. Microbiol., 67, 4111-4118, 2001) han mostrado que la cepa Ruminococcus gnavus E1, aislada de la flora dominante del ser humano, es capaz de producir una sustancia antimicrobiana, denominada ruminococcina A o RumA, que se acumula en el sobrenadante de cultivo. Se trata de una bacteriocina que pertenece a la familia de los lantibióticos, activa contra diferentes cepas de Clostridium sp. patógenas. Gomez et al. (J. Bacteriol., 184, 18-28, 2002) han mostrado que la expresión de los genes implicados en la biosíntesis de la ruminococcina A es inducida en presencia de tripsina. Los mismos autores muestran también que ciertas enzimas digestivas podrían inhibir la inducción de la producción de RumA.

Los inventores se han interesado, por lo tanto, en otras bacteriocinas.

La presente invención se refiere a los péptidos RumC1, RumC2 y RuC3 que presentan una actividad antibacteriana contra Clostridium perfingens, así como a los genes que codifican para estos péptidos.

Descripción de las secuencias SEC ID nº 1: Secuencia peptídica conservada de los péptidos RumC de Ruminococcus gnavus E1

SEC ID nº 3: Secuencia peptídica de los péptidos RumC de Ruminococcus gnavus E1 determinada experimentalmente mediante el método de degradación de Edman SEC ID nº 4: Secuencia peptídica del péptido RumC1 de Ruminococcus gnavus E1 deducida de SEC ID nº 7

SEC ID nº 5: Secuencia peptídica del péptido RumC2 de Ruminococcus gnavus E1 deducida de SEC ID nº 8

SEC ID nº 6: Secuencia peptídica del péptido RumC3 de Ruminococcus gnavus E1 deducida de SEC ID nº 9

SEC ID nº 7: Secuencia nucleotídica del gen rumC1 de Ruminococcus gnavus E1

SEC ID nº 8: Secuencia nucleotídica del gen rumC2 de Ruminococcus gnavus E1

SEC ID nº 9: Secuencia nucleotídica del gen rumC3 de Ruminococcus gnavus E1

SEC ID nº 10, 11 y 12: Secuencias peptídicas determinadas experimentalmente Descripción de la invención La presente invención se refiere a un péptido que tiene una actividad antimicrobiana y más específicamente contra las cepas de Clostridium perfrigens y caracterizado porque comprende un péptido seleccionado de entre los péptidos siguientes: el péptido de la secuencia SEC ID nº 1, un péptido que comprende un péptido que presenta por lo menos el 80% de identidad con el polipéptido de la SEC ID nº 1, el péptido de la secuencia SEC ID nº 2, y un péptido que comprende un péptido que presenta por lo menos el 80% de identidad con el polipéptido de la SEC... [Seguir leyendo]

1. Péptido que tiene una actividad antimicrobiana contra las cepas de Clostridium perfringens, caracterizado porque comprende un péptido seleccionado de entre los péptidos siguientes: 5

- el péptido de la secuencia SEC ID nº 1,

- un péptido que comprende un péptido que presenta por lo menos el 80% de identidad con el polipéptido de la SEC ID nº 1,

- el péptido de la secuencia SEC ID nº 2,

- un péptido que comprende un péptido que presenta por lo menos el 80% de identidad con el polipéptido de la

SEC ID nº 2 15

2. Péptido según la reivindicación 1, que comprende además el péptido de la secuencia SEC ID nº 3.

3. Péptido según la reivindicación 1, que comprende un péptido seleccionado de entre los péptidos de las secuencias SEC ID nº 4, 5 o 6.

4. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que presenta un peso molecular comprendido entre 4000 y 4600 Da, tal como se determina por espectrometría de masas.

5. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, aislado a partir de una cepa de Ruminococcus 25 gnavus mutante.

6. Péptido según la reivindicación 5, aislado a partir de la cepa de Ruminococcus gnavus depositada en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 París) el 19 de diciembre de 2006 bajo el número CNCM I-3705.

7. Polinucleótido que codifica para una actividad antimicrobiana contra las cepas de Clostridium perfringens, caracterizado porque comprende un polinucleótido seleccionado de entre:

-el polinucleótido según cualquiera de las secuencias SEC ID nº 7, 8 o 9, 35

- un polinucleótido que se hibrida de manera selectiva en condiciones de media a fuerte astringencia con el polinucleótido según cualquiera de las secuencias SEC ID nº 7, 8 o 9,

- un polinucleótido que codifica para un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Casete de expresión, caracterizado porque comprende, en el sentido de la transcripción:

- un promotor funcional en un organismo hospedante,

-un polinucleótido según la reivindicación 7, .

45. una secuencia terminadora en el mismo organismo hospedante.

9. Vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 7 y/o un casete de expresión según la reivindicación 8.

10. Organismo hospedante transformado con un polinucleótido según la reivindicación 7, un casete de expresión según la reivindicación 8 y/o un vector según la reivindicación 9.

11. Cepa de Ruminococcus gnavus depositada en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos,

Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 París) el 19 de diciembre de 2006 bajo el número CNCM I-3705. 55

12. Mezcla proteica o mosto de fermentación susceptible de ser obtenida mediante un procedimiento de preparación que comprende las etapas siguientes:

a) cultivo de la cepa según la reivindicación 11 o de un organismo hospedante según la reivindicación 10 en condiciones de inducción de la expresión del péptido, y

b) recuperación del sobrenadante de cultivo que comprende el péptido,

c) opcionalmente, ruptura de las células y purificación del extracto celular. 65

13. Composición que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un organismo hospedante según la reivindicación 10, una cepa según la reivindicación 11, un mosto de fermentación de un organismo hospedante según la reivindicación 10 o un mosto de fermentación de una cepa según la reivindicación 11.

14. Composición según la reivindicación 13, que se presenta en forma líquida o en forma de polvo.

15. Aditivo nutricional que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un organismo hospedante según la reivindicación 10, una cepa según la reivindicación 11, un mosto de fermentación de un organismo hospedante según la reivindicación 10 o un mosto de fermentación de una cepa según la reivindicación 11.

16. Aditivo nutricional según la reivindicación 15, que se presenta en forma líquida o en forma de polvo.

17. Alimento para animales, caracterizado porque comprende una base nutricional para animales y un aditivo 15 nutricional según la reivindicación 15 o 16.

18. Utilización de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, de un organismo hospedante según la reivindicación 10, de una cepa según la reivindicación 11, de un mosto de fermentación de un organismo hospedante según la reivindicación 10 o de un mosto de fermentación de una cepa según la reivindicación 11 para la fabricación de un medicamento, de un aditivo nutricional o de un alimento para animales.

19. Utilización según la reivindicación 18, para la fabricación de un medicamento o de un aditivo nutricional destinado a prevenir o tratar la enteritis necrótica en las aves de corral o en los cerdos.

20. Utilización según la reivindicación 18, para la fabricación de un medicamento o de un aditivo nutricional destinado a prevenir o tratar las enfermedades gastrointestinales en el ser humano.

21. Utilización según la reivindicación 18, según la cual el péptido procede de una cepa endógena o de una cepa exógena del animal. 30

22. Utilización según la reivindicación 18, según la cual el péptido procede de una cepa endógena del animal, y según la cual se favorece la producción del péptido por dicha cepa endógena.

23. Utilización según la reivindicación 18, según la cual el péptido procede de una cepa endógena del animal, y 35 según la cual se favorece el crecimiento de dicha cepa endógena.