Gen abfB-1 de Penicillium funiculosum.

Polipéptido adaptado a la utilización en nutrición animal, caracterizado porque comprende un polipéptidoseleccionado de entre los polipéptidos siguientes:

- el polipéptido de la SEC ID nº 2,

- el polipéptido maduro cuya secuencia está comprendida entre la posición 28 y la posición 507 de la SEC IDnº 2.

Gen abfB-1 de Penicillium funiculosum.

La invención se refiere al gen abfB-1 aislado de Penicillium funiculosum y al polipéptido ABFB-1 codificado por este gen que tiene una actividad α-L-arabinofuranosidasa B.

Penicillium funiculosum es un Talaromyces que pertenece a la familia de las Aspergilleae. El aislamiento de este microorganismo a partir de numerosos sustratos orgánicos sujetos a una contaminación aérea o acuosa, indica que este hongo posee una panoplia de enzimas hidrolíticas de una riqueza sorprendente. La utilización de este cóctel enzimático en la alimentación animal contribuye a la despolimerización de las sustancias orgánicas naturales y permite mejorar su digestibilidad. El documento WO 99/57325 describe así una cepa de Penicillium funiculosum denominada IMI378536 que produce una mezcla de enzimas particularmente adaptada a la alimentación animal. Sin embargo, los cócteles enzimáticos producidos por Penicillium funiculosum están poco caracterizados bioquímicamente. En efecto, sólo un número restringido de actividades enzimáticas como las xilanasas, las β-glucanasas se miden generalmente sobre los mostos de fermentación obtenidos. Estas actividades reflejan sólo una fracción de la población enzimática presente en el cóctel.

Los compuestos hemi-celulolíticos procedentes de la agricultura constituyen la segunda reserva de polisacáridos después de la celulosa en el seno de los tejidos vegetales. Este grupo se caracteriza por una amplia variedad de heteropolisacáridos, de los cuales los principales representantes son los xilanos, los arabinanos, los galactanos, los glucanos, y los mananos. La arabinosa en su forma furfural está ampliamente representada en el seno de los heteropolisacáridos tales como los arabinanos y los arabinoxilados. El arabinano es un polímero de residuos arabinofuranosa unido por unos enlaces α-1-5, y puede estar sustituido con 1 o 2 residuos de arabinosa en posición O-2 u O-3. En lo que se refiere a los arabinoxilanos, los residuos α-L-arabinofuranosilo están unidos sobre la cadena principal β-1-4-xilopiranosilo por unos enlaces α-1-3 y α-1-2. La presencia de residuos arabinosa sobre estas cadenas laterales puede restringir la hidrólisis enzimática de los compuestos hemi-celulolíticos en numerosas aplicaciones industriales tales como la mejora de la digestibilidad de la alimentación animal. Las enzimas que escinden los enlaces α-L-arabinofuranosídicos pueden actuar sinérgicamente con las xilanasas para permitir la hidrólisis de los arabinoxilanos y arabinanos.

Las actividades arabinasas (endo-, exo-arabinasas y mayoritariamente las actividades ∞-L-arabinofuranosidasas) pueden contribuir por lo tanto activamente y de manera sinérgica con las xilanasas a la despolimerización de los compuestos hemi-celulolíticos. Los compuestos hemi-celulolíticos y pécticos pueden representar hasta el 50% de los carbohidratos totales presentes en las plantas, y constituyen una importante fuente de energía para los animales. La mejora de la digestibilidad de estos compuestos está correlacionada con la disminución del grado de sustitución de los residuos arabinosilos en el seno de unos compuestos hemi-celulolíticos (Brice, R.E., Morrison, I.M. 1982, Carbohydr. Res. 101: 93-100) .

Se han aislado las enzimas que hidrolizan los enlaces entre unos residuos L-arabinosa a partir de microorganismos tales como las bacterias o los hongos filamentosos. Las arabinosidasas están constituidas principalmente por α-Larabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55) que son capaces de hidrolizar los residuos α-L-arabinofuranosilo no reductores procedentes del L-arabinoxilano o por compuestos tales como los arabinanos, y los arabinogalactanos.

Se han clasificado las α-L-arabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55) en dos familias de glicósidos hidrolasas (GH 51 y GH 54) según su similitud de secuencia proteica. Estas dos familias difieren debido a su especificidad de sustrato contenido en los polisacáridos. El primer grupo (GH 51) contiene las arabinofuranosidasas de tipo A que actúan sólo sobre pequeñas estructuras lineales de arabinofuranosil-oligosacáridos unidos en α-1-5. El segundo grupo está constituido por arabinofuranosidasas de tipo B (GH 54) que catalizan la hidrólisis de los enlaces α-1, 5; α-1, 3 y α1, 2 de las cadenas laterales contenidas en los compuestos arabinofuranosil-oligosacáridos.

Se han aislado las arabinofuranosidasas B (ABFB) a partir de numerosas bacterias, pero también a partir de hongos filamentosos. El género Aspergillus es el más representado, pero se han aislado también a partir de los géneros Trichoderma, Penicillium, y Fusarium.

Los documentos WO96/29416, WO96/06935, WO 2004/018662 y US nº 5.989.887 describen unos genes de arabinofuranosidasa de Aspergillus niger. La alineación de secuencias proteicas indica que la proteína abfB de A. niger es 72, 4% idéntica a la proteína ABFB-1 de P. funiculosum. En estas solicitudes no se describe ninguna de las características esenciales de la utilización del polipéptido en nutrición animal.

Clinche et al. (J. Agric. Food Chem., 45, 2379-2383, 1997) han descrito tres -L-arabinofuranosidasas procedentes de Aspergillus terreus que tienen una aplicación potencial en enología.

Gielkens et al. (Microbiology, 145, 735-741, 1999) han descrito el gen abfB de Aspergillus nidulans.

Los genes abfB de Aspergillus kawachii y de Aspergillus awamori han sido descritos por Koseki et al. (J. of Bioscience and Bioengineering, vol. 96, nº 3, 232-241, 2003) . Estas enzimas tienen unas aplicaciones en la fermentación del licor japonés shochu.

El gen abfB del hongo filamentoso Trichoderma reesei ha sido descrito por Margolles-Clark et al. (Applied and Environmental Microbiology, 3840-3846, 1996) .

Panagiotou et al. han descrito asimismo dos alpha-L-arabinofuranosidasas extracelulares procedentes de Fusarium oxysporum. (Can J Microbiol. 2003: 49 (10) :639-4) .

Carvallo et al. (Mycol. Res., 107 (4) , 388-394, 2003) han descrito la α-L-arabinofuranosidasa B de Penicillium purpurogenum. La alineación de secuencias proteicas indica que la proteína abf-1 de P. purpurogenum es 85, 6% idéntica a la proteína ABFB-1 de P. funiculosum. En este artículo no se describe ninguna de las características esenciales de la utilización del polipéptido en nutrición animal.

Sakamoto et al. (FEBS Letters 560, 199-204, 2004) han descrito el gen abnx de Penicillium chr y sogenum que codifica sin embargo para una actividad arabinanasa distinta de la actividad de las ABFB.

Sin embargo estas enzimas ABFB no tienen las cualidades óptimas requeridas para una aplicación en la alimentación animal. En efecto, para ser utilizables en alimentación animal, las ABFB deben poseer unas propiedades compatibles con los tratamientos que sufren los alimentos destinados a esta alimentación. En particular, la actividad de las enzimas utilizadas debe ser estable en las condiciones de temperatura y de pH de los procedimientos, y si es posible ser óptima en la preparación de estos alimentos así como en las condiciones presentes en el sistema digestivo de los animales que ingieren estos alimentos.

Además, estas enzimas deben tener un amplio espectro de acción (desenganche) sobre los heteropolisacáridos (arabinasas, arabinoxilanos y arabinogalactanos) para permitir una mejora eficaz de la digestibilidad de los alimentos por los animales. Esta mejora de la digestibilidad de los alimentos para animales permite aumentar su valor nutricional. Así, las enzimas que tienen una especificidad (estereo-especificidad, enantioselectividad) , una actividad

o una afinidad mejorada frente a los sustratos naturales arabinoxilanos y arabinanos presentan un gran interés para la alimentación animal.

La presente invención describe una L-arabinofuranosidasa B (ABFB-1) de Penicillium funiculosum, adaptada para una aplicación en la nutrición animal así como el gen que codifica para esta enzima. La invención se refiere asimismo a los homólogos, a las variantes y a los fragmentos de la ABFB-1 que conservan las mismas propiedades catalíticas.

Ventajosamente, las enzimas ABFB según la invención presentan una temperatura óptima elevada.

Otra ventaja de la presente invención es que la expresión de la ABFB-1 de Penicillium funiculosum está naturalmente fuertemente inducida en este hongo en unas condiciones de inducción de enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas (medio de cultivo de tipo industrial para la producción de enzimas celulolíticas y hemi-celulolíticas) .

Las enzimas según la invención tienen asimismo otras aplicaciones industriales o agro-industriales. Se citará... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido adaptado a la utilización en nutrición animal, caracterizado porque comprende un polipéptido seleccionado de entre los polipéptidos siguientes: 5

-el polipéptido de la SEC ID nº 2,

-el polipéptido maduro cuya secuencia está comprendida entre la posición 28 y la posición 507 de la SEC ID

nº 2. 10

2. Polinucleótido que codifica para una actividad α-L-arabinofuranosidasa B, caracterizado porque se selecciona de entre los polinucleótidos siguientes:

-el polinucleótido cuya secuencia está comprendida entre la posición 845 y la posición 2368 de la SEC ID nº 1.

15. el polinucleótido cuya secuencia está comprendida entre la posición 926 y la posición 2368 de la SEC ID nº 1.

3. Polinucleótido caracterizado porque tiene la secuencia de la SEC ID nº 1 o la secuencia complementaria a la SEC ID nº 1.

4. Casete de expresión, caracterizado porque comprende en el sentido de la transcripción:

-un promotor funcional en un organismo hospedante;

-un polinucleótido según la reivindicación 2; y

-una secuencia terminadora en el mismo organismo hospedante. 25

5. Vector que comprende un polinucleótido según una de las reivindicaciones 2 a 3 y/o un casete de expresión según la reivindicación 4.

6. Organismo hospedante transformado con un polinucleótido según una de las reivindicaciones 2 a 3, un casete de 30 expresión según la reivindicación 4 y/o un vector según la reivindicación 5.

7. Organismo hospedante según la reivindicación 6, caracterizado porque el organismo hospedante se selecciona de entre las levaduras y los hongos filamentosos.

8. Organismo hospedante según la reivindicación 7, caracterizado porque se trata de una cepa de Penicillium funiculosum.

9. Aditivo nutricional para animales, caracterizado porque comprende un polipéptido según la reivindicación 1.

10. Aditivo nutricional para animales, caracterizado porque comprende un organismo hospedante según una de las reivindicaciones 6 a 8 y/o un mosto de fermentación de un organismo hospedante según una de las reivindicaciones 6 a 8.

11. Aditivo nutricional para animales según una de las reivindicaciones 9 a 10, caracterizado porque se presenta en 45 forma líquida o en forma de polvo.

12. Alimento para animales, caracterizado porque comprende una base nutricional para animales y un aditivo nutricional para animales según una de las reivindicaciones 9 a 11.

13. Utilización de un polipéptido según la reivindicación 1 o de un organismo hospedante según una de las reivindicaciones 6 a 8 para la fabricación de un aditivo nutricional para animales o de un alimento para animales.

14. Utilización de un polipéptido según la reivindicación 1 o de un organismo hospedante según una de las reivindicaciones 6 a 8 para la hidrólisis de los enlaces α-L-arabinofuranosilo de los compuestos arabinofuranosil55 oligosacáridos.