FITASA DE DEBARYOMYCES CASTELLII.

Polipéptido, caracterizado porque comprende un polipéptido seleccionado de entre los polipéptidos siguientes:

- el polipéptido de la SEC ID nº 2, - un fragmento del polipéptido de la SEC ID nº 2 que tiene una actividad fitasa, - un polipéptido que tiene una actividad fitasa y que presenta por lo menos 90% de identidad con el polipéptido de la SEC ID nº 2

Fitasa de Debaryomyces castellii.

La presente invención se refiere a una fitasa de Debaryomyces castellii, al gen que codifica esta fitasa, a unos organismos hospedantes recombinantes que expresan esta fitasa, así como a sus aplicaciones en el campo de la nutrición animal en particular.

Las sales del ácido fítico (myo-inositol hexakis fosfato) o fitatos (myo-inositol hexakis(dihidrógeno fosfato) son la forma principal de almacenamiento del fósforo en los cereales, las plantas leguminosas y oleaginosas. Constituyen así la fuente principal de fósforo en los alimentos para animales a base de plantas, componentes principales de los regímenes de los animales monogástricos (aves de corral y cerdos). Sin embargo, la biodisponibilidad de este fósforo en los alimentos está limitada para estos animales. En efecto, éstos no poseen las enzimas intestinales que degradan los fitatos en cantidad suficiente para permitir la hidrólisis de los fitatos y suministrar así las cantidades de fosfato inorgánico que les son necesarias. En el contexto de la nutrición animal, dos características del ácido fítico desempeñan una función importante: (1) los animales monogástricos son poco capaces de degradar el ácido fítico en el aparato digestivo; (2) el ácido fítico es un factor anti-nutricional, que forma unos complejos con las proteínas y los iones (Fe³⁺, Ca²⁺, Zn²⁺, Mg²⁺) y disminuye por lo tanto la disponibilidad de estos elementos.

Las raciones alimenticias de las aves de corral y de los cerdos deben por lo tanto ser suplementadas con fosfato inorgánico mientras que el fósforo de los fitatos es excretado y contribuye a la eutrofización de las aguas de superficie en las zonas de cría intensiva de animales monogástricos.

La complementación de las raciones de los animales monogástricos mediante unas enzimas es una solución utilizada actualmente para mejorar la biodisponibilidad del fósforo unido al fitato y para disminuir la suplementación de los alimentos con fósforo inorgánico y reducir así la excreción de fósforo en las zonas de cría intensiva.

Las fitasas (myo-inositol hexakis fosfato 3- y 6-fosfohidrolasas EC 3.1.3.8 y 3.1.3.26) forman parte de la familia de las histidinas fosfatasas ácidas. Éstas catalizan la hidrólisis del myo-inositol hexakisfosfato (ácido fítico, InsP₆) en monofosfato inorgánico y en myo-inositol fosfato de grado de fosforilación inferior (InsP₅ a InsP₁) y en myo-inositol libre en algunos casos.

Estas enzimas utilizadas como aditivo en la alimentación animal, permiten por un lado aumentar la disponibilidad del fósforo fítico y, por otro lado, mejorar la digestibilidad de los alimentos. Además, la liberación de fosfato fítico disminuye considerablemente los costes debidos a la suplementación con fosfato, así como la contaminación provocada por un exceso de fosfatos excretados.

Las fitasas son producidas por una gran variedad de organismos: plantas, animales y sobre todo microorganismos. Entre los microorganismos productores de fitasas se citarán en particular: Los hongos de los géneros Aspergillus, Penicillium, Mucoret Rhizopus, las bacterias: Pseudomonas sp., Klebsiella sp., Escherichia coli, Enterobacter sp., Bacillus subtilis, y levaduras: Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomyces castellii, Debaryomyces occidentalis, Kluyveromyces fragilis y Schwanniomyces castellii.

En lo que se refiere a las levaduras, Lambrechts et al. (Biotechnology Letters, Vol. 14, nº 1, 61-66, 1992) han identificado diferentes cepas que tienen una actividad fitasa pero no han caracterizado las fitasas correspondientes. La actividad más elevada ha sido medida para la cepa CBS2863 de Schwanniomyces castellii. Unas actividades fitasas han sido observadas asimismo para Candida brumptii CBS 6145, C. tropicalis CBS5696, Debaryomyces castellii CBS 2923, Kluyveromyces fragilis nº 111, K. fragilis CBS 1555, K. fragilis CBS5795, Saccharomyces cerevisiae CBS 1253, Schwanniomyces castellii CBS 2863, Torulopsis candida CBS 940, C. melibiosica CBS 584, K. lactis CBS 2359, T. bovina CBS 2760 y Zygosaccharomyces fennentati CBS6772.

Asimismo, Nakamura Yoshihiro et al. (Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol. 64, nº 4, 841-844, 2000) han identificado diferentes fitasas, pero no las han caracterizado.

Se debe observar además que la clasificación de las levaduras ha sido revisada. Según la nueva clasificación (Nakase T., Suzuki M., Phaff H. J. y Kurtzman C.P., 1998 p157-167 en C. P. Kurtzman y J.W. Fell (ed.), The Yeasts, A taxonomic study, 4ª Ed. Elsevier Sci. Publication Amsterdam), la cepa CBS 2923 corresponde a Debaryomyces castellii Capriotti y la cepa CBS 2863 corresponde a Debaryomyces occidentalis Klocker var. occidentalis, sinónimos Schwanniomyces castellii Capriotti y Schwanniomyces occidentalis Kloker. Los inventores han demostrado que la alineación del polipéptido de la SEC ID nº 2, es decir, la secuencia de la fitasa de Debaryomyces castellii CBS 2923, conduce a un porcentaje de identidad de 69,2% con la secuencia de la fitasa de Schwanniomyces occidentalis CBS 2863.

Numerosas fitasas de microorganismos han sido ya estudiadas y utilizadas en diversas aplicaciones agro-industriales. Sin embargo, la utilización creciente de fitasas como aditivo en numerosas aplicaciones bio-tecnológicas, tal como la alimentación animal aumenta el interés: (1) de aislar nuevos microorganismos productores eficaces de fitasas, (2) de obtener unas fitasas competentes, es decir, que presentan una eficacia para liberar unos fosfatos del alimento en el tracto digestivo, una estabilidad al calor durante el proceso de fabricación del alimento y durante el almacenamiento, y un bajo coste de producción.

Además, la mayoría de las fitasas descritas en la actualidad hidrolizan sólo parcialmente el ácido fítico y algunas con unas cinéticas muy lentas. Además, su actividad de hidrólisis depende en gran medida de sus condiciones de utilización.

En la actualidad, entre las levaduras, sólo la fitasa de la levadura Schwanniomyces occidentalis ha sido descrita como hidrolizante de todos los grupos fosfato del fitato (EP 0 699 762 y Segueilha L., Lambrechts C., Boze H., Moulin G., Galzy P., (1992) Purification and properties of a phytase from Schwanniomyces Castelli, J. Ferm. Bioeng., 74, 7-11). Sin embargo, la fitasa de Schwanniomyces occidentalis es sensible a los cationes (ZnCl₂ y CuCl₂ en particular) lo cual no es favorable para una utilización en la alimentación animal puesto que estos cationes están presentes en el bolo alimenticio (Segueilha et al., 1992). Además, esta enzima es activa en una gama de pH de 2,7 a 5 (EP 0 699 762) y el pCMB inhibe en gran medida la actividad de la fitasa de Schwanniomyces occidentalis, lo cual sugiere que unos grupos SH (puentes disulfuros) están implicados en el sitio activo de la enzima (Segueilha et al., 1992). Además, la biosíntesis de esta fitasa necesita la presencia de fitatos y de sales de calcio (EP 0 699 762). La actividad de esta enzima depende por lo tanto en gran medida del entorno en el que se encuentra. El problema que se propone resolver la presente invención consiste en proponer una fitasa que hidroliza todos los grupos fosfato del fitato y cuya actividad depende poco de las condiciones de utilización de la enzima.

Este inconveniente se resuelve mediante la fitasa de la SEC ID nº 2. De manera ventajosa, esta fitasa es capaz de hidrolizar la totalidad de los grupos fosfato del fitato hasta la liberación del myo-inositol. Posee asimismo un amplio espectro de actividad e hidroliza así numerosos sustratos. De manera ventajosa, la biosíntesis de esta fitasa está inducida por los fitatos, incluso en ausencia de sales de calcio. Ventajosamente, esta fitasa es activa en un intervalo de pH amplio (pH 3 a 6,5) y no es sensible a los cationes o al pCMB. La enzima es asimismo termoestable hasta 66ºC. La enzima de la presente invención es por lo tanto extremadamente robusta, lo cual es favorable para una utilización en alimentación animal pero también en otras aplicaciones industriales.

La invención se refiere asimismo a unas fitasas...

1. Polipéptido, caracterizado porque comprende un polipéptido seleccionado de entre los polipéptidos siguientes:

- el polipéptido de la SEC ID nº 2,

- un fragmento del polipéptido de la SEC ID nº 2 que tiene una actividad fitasa,

- un polipéptido que tiene una actividad fitasa y que presenta por lo menos 90% de identidad con el polipéptido de la SEC ID nº 2.

2. Polinucleótido que codifica para una actividad fitasa, caracterizado porque se selecciona de entre los polinucleótidos siguientes:

- el polinucleótido cuya secuencia está comprendida entre la posición 1538 y la posición 2923 de la SEC ID nº 1,

- un polinucleótido que codifica para un polipéptido según la reivindicación 1.

3. Polinucleótido, caracterizado porque tiene la secuencia de la SEC ID nº 1 o la secuencia complementaria a la SEC ID nº 1.

4. Casete de expresión, caracterizado porque comprende, en el sentido de la transcripción:

- un promotor funcional en un organismo hospedante;

- un polinucleótido según la reivindicación 2; y

- una secuencia terminadora en el mismo organismo hospedante.

5. Vector que comprende un polinucleótido según una de las reivindicaciones 2 a 3, y/o un casete de expresión según la reivindicación 4.

6. Procedimiento de transformación de un organismo hospedante mediante la integración en dicho organismo hospedante

- de por lo menos un polinucleótido según una de las reivindicaciones 2 ó 3,

- de un casete de expresión según la reivindicación 4, o

- de un vector según la reivindicación 5,

siendo dicho organismo hospedante Pichia Pastoris.

7. Aditivo nutricional para animales, caracterizado porque comprende un polipéptido según la reivindicación 1.

8. Aditivo nutricional para animales, caracterizado porque comprende un organismo hospedante según la reivindicación 6 y/o un mosto de fermentación de un organismo hospedante según la reivindicación 6.

9. Aditivo nutricional para animales según una de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque se presenta en forma líquida o en forma de polvo.

10. Alimento para animales, caracterizado porque comprende una base nutricional para animales y un aditivo nutricional para animales según una de las reivindicaciones 7 a 9.

11. Alimento para animales, caracterizado porque comprende un polipéptido según la reivindicación 1, un organismo hospedante obtenido mediante el procedimiento según la reivindicación 6 y/o un mosto de fermentación de un organismo hospedante obtenido mediante el procedimiento según la reivindicación 6.

12. Utilización de un polipéptido según la reivindicación 1 o de un organismo hospedante obtenido mediante el procedimiento según la reivindicación 6 para la fabricación de un aditivo nutricional para animales o de un alimento para animales.

13. Utilización de un polipéptido según la reivindicación 1 o de un organismo hospedante obtenido mediante el procedimiento según la reivindicación 6 para la hidrólisis del myo-inositol hexakisfosfato en monofosfato inorgánico, en myo-inositol de grado de fosforilación inferior y en myo-inositol libre.