Gen ABFB-2 de Penicillium funiculosum.

Polipéptido caracterizado por que comprende un polipéptido seleccionado de entre los polipéptidos siguientes:

- el polipéptido de la SEC ID nº 2,

- el polipéptido cuya secuencia está comprendida entre la posición 28 y la posición 400 de la SEC ID nº 2,

- un fragmento del polipéptido de la SEC ID nº 2 que tiene una actividad α-L-arabinofuranosidasa B,

- un polipéptido que tiene una actividad α-L-arabinofuranosidasa B y que presenta por lo menos 80% de identidad con el polipéptido de la SEC ID nº 2.

Gen ABFB-2 de Penicillium funiculosum.

La invención se refiere al gen afbB-2 aislado de Penicillium funiculosum y al polipéptido ABFB-2 codificado por este gen que tiene una actividad a-L-arabinofuranosidasa B.

Penicillium funiculosum es un Talaromices que pertenece a la familia de los Aspergilleae. El aislamiento de este microorganismo a partir de numerosos sustratos orgánicos sujetos a una contaminación aérea o acuosa indica que este hongo posee una panoplia de enzimas hidrolíticas de una riqueza sorprendente. La utilización de este cóctel enzimático en la alimentación animal contribuye a la despolimerización de las sustancias orgánicas naturales y permite mejorar su digestibilidad. El documento WO 99/57325 describe de este modo una cepa de Penicillium funiculosum denominada IMI378536 que produce una mezcla de enzimas particularmente adaptada a la alimentación animal. Sin embargo, los cócteles enzimáticos producidos por Penicillium funiculosum están poco caracterizados bioquímicamente. En efecto, sólo un número limitado de actividades enzimáticas como las xilanasas, las (3-glucanasas se miden generalmente sobre los mostos de fermentación obtenidos. Estas actividades no reflejan más que una porción de la población enzimática presente en el cóctel.

Los compuestos hemicelulolíticos procedentes de la agricultura constituyen la segunda reserva de polisacáridos después de la celulosa en el seno de los tejidos vegetales. Este grupo se caracteriza por una gran variedad de heteropolisacáridos, de los cuales los principales representantes son los xilanos, los arabinanos, los galactanos, los glucanos y los mananos. La arabinosa en su forma furfural está ampliamente representada en el seno de los heteropolisacáridos tales como los arabinanos y los arabinoxilanos. El arabinano es un polímero de residuos arabinofuranosa unidos por enlaces a-1-5 y puede estar sustituido por 1 o 2 residuos arabinosa en posición -2 u -3. Con respecto a los arabinoxilanos, los residuos a-L-arabinofuranosilo están unidos a la cadena principal (3-1 -4- xilopiranosilo mediante unos enlaces a-1-3 y a-1-2. La presencia de residuos arabinosa en estas cadenas laterales puede restringir la hidrólisis enzimática de los compuestos hemicelulolíticos en numerosas aplicaciones industriales tales como la mejora de la digestibilidad de la alimentación animal. Las enzimas que cortan los enlaces a-L- arabinofuranosídicos pueden actuar de forma sinérgica con las xilanasas para permitir la hidrólisis de los arabinoxilanos y arabinanos.

Las actividades arabinasas (endo-, exoarabinasas y mayoritariamente las actividades a-L-arabinofuranosidasas) pueden por lo tanto contribuir activamente y de forma sinérgica con la xilanasas a la despolimerización de los compuestos hemicelulolíticos. Los compuestos hemicelulolíticos y pécticos pueden representar hasta un 5% de los carbohidratos totales presentes en las plantas y constituyen una importante fuente de energía para los animales. La mejora de la digestibilidad de estos compuestos está correlacionada con la disminución del grado de sustitución de los residuos arabinosilos en el seno de los compuestos hemicelulolíticos (Brice, R.E., Morrison, I.M. 1982, Carbohydr. Res. 11 : 93-1).

Las enzimas que hidrolizan los enlaces entre residuos L-arabinosa han sido aisladas a partir de microorganismos tales como las bacterias o los hongos filamentosos. Las arabinosidasas están constituidas principalmente por a-L- arabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55) que son capaces de hidrolizar los residuos a-L-arabinofuranosilo no reductores procedentes del L-arabinoxilano o de compuestos tales como los arabinanos y los arabinogalactanos.

Las a-L-arabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55) se han clasificado en dos familias de glucósido hidrolasas (GH 51 y GH 54) según sus similitudes de secuencia proteica. Estas dos familias difieren en su especificidad de sustrato contenido en los polisacáridos. El primer grupo (GH 51) contiene las arabinofuranosidasas de tipo A que actúan solamente sobre estructuras pequeñas lineales de oligosacáridos arabinofuranosilo unidos en a-1-5. El segundo grupo está constituido por arabinofuranosidasas de tipo B (GH 54) que catalizan la hidrólisis de los enlaces a-1,5; a- 1,3 y a-1,2 de las cadenas laterales contenidas en los compuestos oligosacáridos de arabinofuranosilo.

Las arabinofuranosidasas B (ABFB) han sido aisladas a partir de numerosas bacterias pero también a partir de hongos filamentosos. El género Aspergillus es el más representado, pero también han sido aisladas a partir de los géneros Trichoderma, Penicillium y Fusarium.

Los documentos WO 96/29416, WO 96/6935 y US n° 5.989.887 describen unos genes de arabinofuranosidasa de Aspergillus niger.

Gielkens et al. (Microbiology, 145, 735-741, 1999) han descrito el gen abfB de Aspergillus nidulans.

Los documentos WO 96/29416, WO 96/6935, WO 24/18662 y US n° 5.989.887 describen unos genes de arabinofuranosidasa de Aspergillus niger. La alineación de secuencias proteicas indica que la proteína afbB de A. niger es 5,9% idéntica a la proteína ABFB-2 de P. funiculosum. No está descrita ninguna de las características esenciales de la utilización del polipéptido en nutrición animal en estas solicitudes.

Clinche et al. (J. Agrie. Food Chem., 45, 2379-2383, 1997) han descrito tres a-L-arabinofuranosidasas procedentes

de Aspergillus terreus que tienen una aplicación potencial en enología.

Los genes abfB de Aspergillus kawachii y de Aspergillus awamori han sido descritos por Koseki et al. (J. of Bioscience and Bioengineering, vol. 96, no. 3, 232-241, 23). Estas enzimas tienen aplicaciones en la fermentación del licor japonés shochu.

El gen abfB del hongo filamentoso Trichoderma reesei ha sido descrito por Margolles-Clark et al. (Applied and Environmental Microbiology, 384-3846, 1996).

Panagiotou et al. también han descrito dos alfa-L-arabinofuranosidasas extracelulares procedentes de Fusarium oxysporum. (Can J Microbiol. 23 : 49(1):639-4).

Carvallo et al. (Mycol. Res., 17 (4), 388-394, 23) han descrito la a-L-arabinofuranosidasa B de Penicillium purpurogenum. La alineación de secuencias indica que la proteína abf-1 de P. purpurogenum es 51,2% idéntica a la proteína ABFB-2 de P. funiculosum. No está descrita ninguna de las características esenciales de la utilización del polipéptido en nutrición animal en este artículo.

Sakamoto et al. (FEBS Letters 56, 199-24, 24) han descrito el gen abnx de Penicillium chrysogenum que codifica sin embargo para una actividad arabinanasa distinta de la actividad de las ABFB.

Sin embargo, estas enzimas ABFB no tienen las calidades óptimas requeridas para una aplicación en alimentación animal.

En efecto, para ser utilizables en alimentación animal, las ABFB deben poseer unas propiedades compatibles con los tratamientos que sufren los alimentos destinados a esta alimentación. En particular, la actividad de las enzimas utilizadas debe ser estable bajo las condiciones de temperatura y de pH de los procedimientos, y si es posible, ser óptimas en la preparación de estos alimentos así como bajo las condiciones presentes en el sistema digestivo de los animales que ingieren estos alimentos.

Además, estas enzimas deben tener un amplio espectro de acción (desramaje) sobre los heteropolisacáridos (arabinanos, arabinoxilanos y arabinogalactanos) para permitir una mejora eficaz de la digestibilidad de los alimentos por los animales. Esta mejora de la digestibilidad de los alimentos para animales permite aumentar su valor nutricional. De este modo, las enzimas que tienen una especificidad (estereoespecificidad, enantioselectividad), una actividad o una afinidad mejorada sobre los sustratos naturales arabinoxilanos y arabinanos presentan un gran interés para la alimentación animal.

Además, antes de la hidrólisis de los enlaces arabinofuranosilo, es indispensable despolimerizar previamente las moléculas complejas tales como la celulosa. Las enzimas celulolíticas (celulasas) de hongo poseen en general un dominio fCDB (dominio de fijación a la celulosa de tipo fúngico) que juega un papel preponderante en esta despolimerización de la celulosa.

La presente invención describe una L-arabinofuranosidasa B (ABFB-2) de Penicillium funiculosum, adaptada para una aplicación en la nutrición animal, así como el gen que codifica para esta enzima. La invención se refiere también a los homólogos, las variantes y los fragmentos de ABFB-2 que conservan las mismas propiedades catalíticas.

Ventajosamente, las enzimas ABFB según la invención presentan un pH óptimo muy ácido (pH 2,6) y conservan 55% de su actividad a pH 1,5.

Ventajosamente, la enzima ABFB-2 posee un dominio de fijación a la... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido caracterizado por que comprende un polipéptido seleccionado de entre los polipéptidos siguientes:

el polipéptido de la SEC ID n° 2,

el polipéptido cuya secuencia está comprendida entre la posición 28 y la posición 4 de la SEC ID n° 2,

un fragmento del polipéptido de la SEC ID n° 2 que tiene una actividad a-L-arabinofuranosidasa B,

un polipéptido que tiene una actividad a-L-arabinofuranosidasa B y que presenta por lo menos 8% de identidad con el polipéptido de la SEC ID n° 2.

2. Polinucleótido que codifica una actividad a-L-arabinofuranosidasa B, caracterizado por que se selecciona de entre los polinucleótidos siguientes:

el polinucleótido cuya secuencia está comprendida entre la posición 268 y la posición 147 de la SEC ID n°

1,

el polinucleótido cuya secuencia está comprendida entre la posición 349 y la posición 147 de la SEC ID n° 1

un polinucleótido que codifica un polipéptido según la reivindicación 1.

3. Polinucleótido caracterizado por que presenta la secuencia de la SEC ID n° 1 o la secuencia complementaria a la SEC ID n° 1.

4. Casete de expresión, caracterizado por que comprende en el sentido de la transcripción:

un promotor funcional en un organismo hospedador;

un polinucleótido según la reivindicación 2; y

una secuencia terminadora en el mismo organismo hospedador.

5. Vector que comprende un polinucleótido según una de las reivindicaciones 2 a 3 y/o un casete de expresión según la reivindicación 4.

6. Organismo hospedador no humano transformado con un polinucleótido según una de las reivindicaciones 2 a 3, un casete de expresión según la reivindicación 4 y/o un vector según la reivindicación 5.

7. Organismo hospedador según la reivindicación 6, caracterizado por que el organismo hospedador se selecciona de entre las levaduras y los hongos filamentosos.

8. Organismo hospedador según la reivindicación 7, caracterizado por que se trata de una cepa de Penicillium funiculosum.

9. Aditivo nutricional para animales, caracterizado por que comprende un polipéptido según la reivindicación 1.

1. Aditivo nutricional para animales, caracterizado por que comprende un organismo hospedador según una de las reivindicaciones 6 a 8 y/o un mosto de fermentación de un organismo hospedador según una de las reivindicaciones 6 a 8.

11. Aditivo nutricional para animales según una de las reivindicaciones 9 a 1, caracterizado por que se presenta en forma líquida o en forma de polvo.

12. Alimento para animales, caracterizado por que comprende una base nutricional para animales y un aditivo nutricional para animales según una de las reivindicaciones 9 a 11.

13. Utilización de un polipéptido según la reivindicación 1 o de un organismo hospedador según una de las reivindicaciones 6 a 8 para la preparación de un aditivo nutricional para animales o de un alimento para animales.

14. Utilización de un polipéptido según la reivindicación 1 o de un organismo hospedador según una de las reivindicaciones 6 a 8 para la hidrólisis de los enlaces a-L-arabinofuranosilo de los compuestos oligosacáridos de arabinofuranosilo.