Péptidos antimicrobianos.

Péptido con actividad antimicrobiana y neutralizadora de endotoxinas que consiste en la fórmula:

(Xaa1)M-Trp-(Xaa4)P-Arg-(Xaa7)R-(Arg)S, en la que:

Xaa1 se selecciona de entre el grupo que consiste en prolina (Pro) y fenilalanina (Phe),

Xaa4 se selecciona de entre el grupo que consiste en arginina (Arg), triptófano (Trp) e isoleucina (Ile),

Xaa7 se selecciona de entre el grupo que consiste en isoleucina (Ile), triptófano (Trp) y fenilalanina (Phe), y en la que:

M es 1, 2 o 3,

R es 1 o 2,

P es 1, 2 o 3, y

S es 1 o 2.

Péptidos antimicrobianos.

La presente invención se refiere a nuevas familias de péptidos y lipopéptidos que presentan actividades 5 antimicrobianas y neutralizadoras de endotoxinas. Los nuevos compuestos pueden utilizarse además en terapia de combinación con antibióticos o agentes antiendotóxicos convencionales. Además, la presente invención da a conocer procedimientos para preparar y utilizar los nuevos compuestos.

La creciente incidencia de bacterias patogénicas que son resistentes a antibióticos disponibles comercialmente ha 10 comportado un creciente interés en el desarrollo de péptidos como fármacos antibacterianos. En efecto, una gran fracción de las infecciones adquiridas en el hospital (hasta el 70%) actualmente se debe a bacterias resistentes a antibióticos. Además de los problemas de resistencia a fármacos, el tratamiento antibiótico de las infecciones Gram-negativas puede provocar una liberación de endotoxina, que induce choque séptico, representando un reto adicional para la terapia antimicrobiana. El choque séptico es la causa principal de mortalidad en las unidades de cuidados 15 intensivos. Las bacterias Gram-negativas en particular contienen lipopolisacáridos (o LPS) en su cubierta, los cuales son los inductores de esta respuesta más potentes que se conocen. Además, los antibióticos utilizados actualmente para las infecciones Gram-negativas pueden eliminar bacterias, pero la administración de antibióticos no neutraliza los LPS liberados a partir de las membranas externas de las bacterias muertas. Esta liberación de LPS de hecho puede incrementar las lesiones pulmonares y conducir al síndrome séptico. Por lo tanto, los agentes que presentan 20 propiedades antimicrobianas y neutralizan las endotoxinas liberadas resultarían muy valiosos en el tratamiento de la infección bacteriana.

Debido a que las bacterias han evolucionado para presentar múltiples resistencias a un gran número de antibióticos existentes, la nueva clase de compuestos es más probable que minimicen la rápida emergencia de las resistencias 25 bacterianas. La naturaleza nos ha enseñado que las moléculas efectoras de la inmunidad innata de los mamíferos pueden proporcionar una primera línea de defensa contra un abanico sustancial de microorganismos patogénicos. En particular, los péptidos de defensa del huésped se consideran moléculas efectoras multifuncionales y representan nuevas fuentes para el desarrollo de agentes terapéuticos con los que superar la resistencia antimicrobiana. Aunque muchos antibióticos convencionales dañan o eliminan las bacterias en un periodo de días, la 30 mayoría de péptidos antimicrobianos matan de manera prácticamente instantánea, es decir, en minutos. Una diversidad de péptidos antimicrobianos bloquean además la interacción de los LPS con sus receptores, tales como LBP, CD14 y MD-2/TLR4, resultando en la inhibición de la activación de los macrófagos, una característica que podría reducir la toxicidad de los LPS.

Las lactoferrinas son glucoproteínas endógenas ligantes de hierro que se encuentran en las secreciones exocrinas de los mamíferos y en los gránulos de los neutrófilos durante la respuesta inflamatoria que presentan actividad antimicrobiana y ligante de LPS. Las lactoferrinas presentan propiedades multifuncionales, incluyendo propiedades antibacterianas, antifúngicas, antivíricas, antitumorales, antiinflamatorias e inmunorreguladoras. Es conocido que la lactoferrina y derivados presentan la capacidad de neutralizar las endotoxinas bacterianas (LPS) , protegiendo de 40 esta manera a los organismos de los efectos dañinos de la sepsis. De esta manera, los numerosos informes de sus actividades antimicrobianas y antiinflamatorias in vitro identifican la lactoferrina como importante en la defensa del huésped frente a la infección y la inflamación excesiva. La digestión proteolítica in vitro e in vivo de la lactoferrina humana rinde un fragmento peptídico denominado lactoferricina, la cual presenta una actividad antimicrobiana incrementada en comparación con la lactoferrina integral. Varios derivados sintéticos más cortos de la lactoferricina 45 muestran actividad antimicrobiana contra las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas y se unen específicamente a LPS (StrÃm et al., J. Peptide Res. 57:127-139, (2001) ) . Aunque muchos péptidos de defensa del huésped resultan prometedores como nuevos candidatos antimicrobianos, la lactoferrina humana y derivados son únicos en el aspecto de que presentan actividades multifuncionales y, debido a su origen humano, es menos probable que induzcan efectos fisiológicos adversos. 50

El sustrato de quinasa C rico en alaninas miristoilado (MARCKS) y las proteínas relacionadas con MARCKS son los sustratos de la proteína quinasa C principales en muchos tipos celulares. Se ha encontrado que la transcripción de MARCKS se encuentra significativamente regulada positivamente mediante estimulación de los macrófagos y las células microgliales en respuesta a las LPS bacterianos. El motivo de unión a LPS sobre MARCKS es muy similar a 55 los potentes hexapéptidos antimicrobianos identificados utilizando enfoques de librería combinatorial. Debido a que MARCKS es modificado naturalmente mediante miristoilación N-terminal, puede preverse que la inserción de grupos lipofílicos en los derivados de MARCKS más cortos pueda resultar en una potente actividad antimicrobiana y/o unión a LPS.

La relevancia de la hidrofobicidad y en particular la presencia de cadenas alquilo o acilo de lipopéptidos para su actividad antimicrobiana ha sido descrita para lipopéptidos (por ejemplo polimixinas, octapeptinas y daptomicina) . Además, las polimixinas presentan una elevada afinidad para las moléculas de LPS y permeabilizan la membrana externa alterando los grupos de cabeza cargados negativamente, mediante el desplazamiento de cationes divalentes de sus sitios de unión en los LPS. La acilación del extremo N-terminal de un péptido central nonámero de 65 la lactoferricina B resulta en una actividad antimicrobiana mejorada. Recientemente se han aislado a partir de muestras de suelo antibióticos de N-acil-aminoácido de cadena larga. También se ha informado de que las lipopoliaminas (DOSPER, DOSPA y DOGS, la totalidad de las cuales contiene una cadena de alquilo C17) muestran actividad antiendotoxina mediante secuestro de LPS y, a su vez, mediante bloqueo de los eventos de activación celular aguas abajo que conducen a la producción de mediadores proinflamatorios. Aunque ineficaces al someterlas a ensayo solas en ratas neutropénicas con bacteremia Gram-negativa invasiva causada por Pseudomonas 5 aeruginosa, al administrarlas con el antibiótico ceftazimidina, estas lipopoliaminas incrementaron significativamente la tasa de supervivencia en comparación con la ceftazimidina sola.

Se prevé que desarrollos en curso de nuevos sistemas de administración incrementen el potencial de los péptidos en el campo terapéutico contra enfermedades infecciosas. Por ejemplo, la administración de péptidos en el tejido 10 cerebral ahora resulta posible, con el reciente desarrollo de la estrategia de péptidos quiméricos (Bickel et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 46:247-279, (2001) ) . Se ha informado de que un caso exitoso de pneumonectomía y posterior tratamiento con fibra con polimixina B inmovilizada y hemodiafiltración continua ha conducido a la eliminación de los factores causativos de sepsis ("choque séptico") en un paciente que sufría tuberculosis pulmonar (Takahashi et al., Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. 9:319-322, 2003) . De manera similar, para mejorar la biodisponibilidad de los 15 fármacos peptídicos tras la administración oral, diversas estrategias se encuentran en desarrollo. Entre ellas se incluyen la administración de fármacos en forma de partículas, tales como nanopartículas, microcápsulas, liposomas o emulsiones, la administración mucoadhesiva y la utilización de intensificadores de la penetración (Kompella et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 46:211-245, (2001) ) .

Japelj B. et al. (J. Biol. Chem. 280 (17) :16955-61, 2005) se refiere a un péptido neutralizador de endotoxinas (LF11) que comprende la secuencia de aminoácidos FQWQRNIRKVR-NH2, derivada de la lactoferrina. Durante el curso de estos estudios se determinó el residuo aminoácido de LF11 que era responsable de la unión a LPS.

De manera comparable a Japelj B. et al., también en Andra J. et al. (Biochem. J. 385:135-43, 2005) , se ha analizado 25 la interacción del péptido LF11 derivado de la lactoferrina, que se acopló a una cadena de alquilo C12, con LPS.

En Farnaud S. et al. (FEMS Microbiol. Lett. 238 (1) :221-6, 2004) se dan a conocer péptidos antimicrobianos que se han derivado de lactoferrina bovina y humana. Los autores de este trabajo científico... [Seguir leyendo]

1. Péptido con actividad antimicrobiana y neutralizadora de endotoxinas que consiste en la fórmula:

(Xaa1) M-Trp- (Xaa4) P-Arg- (Xaa7) R- (Arg) S, en la que: 5

Xaa1 se selecciona de entre el grupo que consiste en prolina (Pro) y fenilalanina (Phe) ,

Xaa4 se selecciona de entre el grupo que consiste en arginina (Arg) , triptófano (Trp) e isoleucina (Ile) , 10

Xaa7 se selecciona de entre el grupo que consiste en isoleucina (Ile) , triptófano (Trp) y fenilalanina (Phe) , y en la que:

M es 1, 2 o 3, R es 1 o 2, 15

P es 1, 2 o 3, y S es 1 o 2.

2. Péptido según la reivindicación 1, caracterizado por que la fórmula comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en FWRRWRR (SEC ID nº 40) , FWRRWIRR (SEC ID nº 41) , 20 FWRRFWRR (SEC ID nº 43) , FWRWRWR (SEC ID nº 44) , FWRIWRWR (SEC ID nº 45) , FWRIWRIWR (SEC ID nº 46) , PFWRWRIWR (SEC ID nº 50) , PFWRIRIRR (SEC ID nº 51) , PFWRRRIRR (SEC ID nº 57) , PFWRRRWRR (SEC ID nº 58) , PFFWRIRIRR (SEC ID nº 60) , PWRIRIRR (SEC ID nº 61) , FWRWRIWR (SEC ID nº 74) , FWRIRIRR (SEC ID nº 75) , PWRRIRR (SEC ID nº 83) y PFWRRIRIRR (SEC ID nº 85) .

3. Péptido según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el extremo C-terminal consiste preferentemente de un grupo seleccionado de entre el grupo que consiste en un grupo N-metilamido o un grupo carboxilo o seleccionado de entre el grupo de las amidas, ésteres, éteres o cetonas, comprendiendo preferentemente entre 1 y 120 átomos de carbono, más preferentemente entre 1 y 10 átomos de carbono, en particular que consiste en un grupo N-metilamido. 30

4. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que un grupo acilo se encuentra unido al extremo N-terminal o C-terminal del péptido.

5. Péptido según la reivindicación 4, caracterizado por que el grupo acilo es una cadena hidrofóbica seleccionada 35 de entre el grupo que consiste en cadenas acilo lineales y ramificadas saturadas e insaturadas de C2-C20, derivados de bencilo y F-moc.

6. Péptido según la reivindicación 4 o 5, caracterizado por que el grupo acilo se selecciona de entre el grupo que consiste en grupo dodecanoilo, grupo decanoilo, grupo octanoilo, grupo hexanoilo, grupo 2-metilhexanoilo, grupo 2-40 etilhexanoilo, grupo 2-propilpentanoilo, grupo 2-butiloctanoilo, grupo 2, 2-dimetilbutanoilo, grupo 2-metilpentanoilo, grupo 3-metilpentanoilo, grupo 4-metilpentanoilo, grupo 6-metil-octanoilo, grupo bencilo y grupo diciclohexilacetilo.

7. Composición farmacéutica que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Composición según la reivindicación 7, que comprende por lo menos un agente antimicrobiano o antiséptico adicional.

9. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su utilización como agente antimicrobiano, neutralizador de endotoxinas o agente antifúngico. 50

10. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su utilización en el tratamiento o la prevención de infecciones causadas por microorganismos, preferentemente por bacterias y/o hongos, o la sepsis o el choque séptico causado preferentemente por endotoxinas.

11. Péptido para su utilización según la reivindicación 10, caracterizado por que el medicamento comprende o se caracteriza además porque se utiliza con por lo menos un agente antimicrobiano o antiséptico adicional.

12. Método de inhibición del crecimiento in vitro de por lo menos un microorganismo, que comprende la etapa de poner en contacto dicho microorganismo con una cantidad eficaz de un péptido según cualquiera de las 60 reivindicaciones 1 a 6.

13. Método según la reivindicación 12, caracterizado por que dicho microorganismo es una bacteria Gram-positiva o Gram-negativa.

14. Método para preparar un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que presenta un residuo N-terminal de prolina, que comprende las etapas siguientes:

- proporcionar una célula huésped que comprende una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido o proteína de fusión que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que 5 presenta un residuo N-terminal de prolina, en el que el péptido se encuentra fusionado en el extremo C-terminal a dicho polipéptido o proteína que presenta un aspartato C-terminal,

- expresar y aislar dicho polipéptido o proteína de fusión, 10

- someter el polipéptido o proteína de fusión aislado a un valor de pH de entre 0, 5 y 4.

15. Método de adsorción y eliminación o inactivación de bacterias o componentes bacterianos de muestras, que comprende las etapas de poner en contacto dicha muestra con péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 inmovilizado. 15