PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE UNA ENZIMA INMOVILIZADA EN UN SOPORTE RENOVABLE DERIVADO DE UN RESIDUO AGROALIMENTARIO.

Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada en un soporte renovable derivado de un residuo agroalimentario.

Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada en un soporte, caracterizado porque comprende: a) obtener un soporte renovable por tratamiento térmico de un residuo agroalimentario que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en sílice, óxido de catión alcalino, óxido de catión alcalinotérreo y mezcla de los anteriores, e b) inmovilizar la enzima en el soporte obtenido en la etapa anterior. Preferiblemente, la enzima es lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEO ID N° 1) y el residuo agroalimentario es cáscara de arroz. Así como el soporte obtenido en la etapa a), la enzima inmovilizada obtenida en la etapa b) y su uso para obtener biodiesel.

Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada en un soporte renovable derivado de un residuo agroalimentario

SECTOR TÉCNICO

La presente invención se sitúa dentro del campo de la biotecnología, ya que se refiere a una enzima inmovilizada en un soporte renovable y sus usos, entre otros, en el campo de la química-fina y biocatálisis. Así, las enzimas inmovilizadas en soportes renovables obtenidos a partir de residuos agroalimentarios de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar en la síntesis enantiomérica de compuestos químicos de alto valor añadido, entre otras, para la industria farmacéutica, o como biocatalizadores en biotransformaciones tal como, por ejemplo, la síntesis de biodiesel.

Adicionalmente, la presente invención también se puede situar en el sector del reciclado ya que utiliza material de desecho de la industria agroalimentaria, preferiblemente cáscara de arroz, para obtener el soporte renovable donde se inmoviliza la enzima.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las enzimas son moléculas de gran interés por sus numerosas aplicaciones industriales en campos tan diversos como la alimentación, por ejemplo, en la obtención de productos deslactosados, edulcorantes, zumos, jarabes de glucosa, piensos animales, etc.; en la obtención de biocombustibles, por ejemplo, bioetanol de primera y segunda generación, biodiesel; detergentes; fármacos tal como, por ejemplo, antibióticos semisintéticos, compuestos enantioméricamente puros; polímeros; ingredientes funcionales, por ejemplo, prebióticos, grasas enriquecidas con ácidos grasos poliinsaturados; o en medicina, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades genéticas o análisis clínicos.

En particular, las lipasas son enzimas de la familia de las hidrolasas, capaces de hidrolizar triglicéridos en diglicéridos, monoglicéridos, ácidos grasos y glicerol, actuando sobre los enlaces éster carboxílicos de los triglicéridos. Son importantes en el cuerpo humano pues facilitan la absorción de grasas. Las lipasas suponen más de la cuarta parte del total de las enzimas utilizadas en biotransformaciones, siendo su elevado coste de producción, su único inconveniente para su uso industrial. En la industria se usan para fabricar jabones y detergentes por hidrólisis de sebo, para producción de leche infantil por estructuración o modificación de lípidos, en la industria quesera, para hidrolizar la grasa de la leche. También pueden resolver mezclas racémicas mediante estrategias de hidrólisis, esterificación o transesterificación, dando lugar a un solo enantiómero de la mezcla (enantioselectividad), lo que se usa por ejemplo en la industria farmacéutica para la producción de fármacos quirales (A.-L. Groussin, S. Antoniotti, Valuable Chemicals by the enzymatic modification of molecules of natural origin: Terpenoids, steroids, phenolics and related. Bioresource Technology 115 (2012) 237-243).

La inmovilización de enzimas es interesante porque permite reusar los biocatalizadores, y puede ayudar a aumentar su resistencia contra la inactivación. En el desarrollo de enzimas inmovilizadas se han de tener en cuenta varias propiedades importantes para sus aplicaciones industriales, como son la fuerza mecánica, la estabilidad química y física, el carácter hidrofóbico/hidrofílico, la cantidad de enzima inmovilizada y el coste.

Actualmente, y como alternativa al método covencional de catálisis básica, se está investigando la producción de biodiesel mediante el empleo de enzimas, principalmente

lipasas, inmovilizadas para catalizar reacciones de transesterificación, esterificación e interesterificación. En particular, N. Digze et al. describe la producción de biodiesel por transesterificación de aceite de girasol, soja y residuos de cocina utilizando una lipasa inmovilizada en un polímero microporoso obtenido a partir de estireno, divinilbenceno y poliglutaraldehido (N. Digze et al. Biodiesel production from sunflower, soybean, and waste cooking oils by transesterification using lipasa immobilized onto a novel microporous polymer. Biosource Technology, 100 (2009), 1983-1991). Por otro lado, N.W. Li et al. describe la utilización de lipasa de Penicillium exapansum inmovilizada en resina D4020 en la transesterificación de aceite de maíz (N.W. Li et al. Immobilization Chínese Journal of Catalysis, Vol 8(4), 2007).

Por otro lado, en la patente EP 444092 B1 (Particulate immobilized lipase preparation, method for production thereof and use thereof, de Novo Norkisk) se describen partículas de una lipasa microbiana, en particular lipasas derivadas de cepas de especies Humicola, Candida antárctica o Rhizomucor miehei, inmovilizada en un soporte macroporoso, donde dicho soporte consiste en al menos 65 % de silica o silicatos, más del 90 % de las partículas tienen un tamaño de partícula entre 100 y 1000 pm, más del 80 % de los poros de las partículas muestra un diámetro entre 10 y 45 veces el diámetro de los glóbulos de lipasa, y donde el contenido de agua de las partículas de lipasa inmovilizadas se encuentra entre 1 y 20 %. En este documento también se describe el procedimiento de inmovilización de las lipasas y su uso en la interesterificación de grasas, la hidrólisis de grasas y la síntesis de glicéridos u otros esteres de ácidos graso.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada en un soporte, caracterizado porque comprende:

a) obtener un soporte renovable por tratamiento térmico de un residuo agroalimentario que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en sílice, óxido de catión alcalino, óxido de catión alcalinotérreo y mezcla de los anteriores, e

b) inmovilizar la enzima en el soporte obtenido en la etapa anterior.

El procedimiento de la presente invención utiliza residuos agroalimentarios como material de partida para la obtención del soporte renovable donde se inmoviliza la enzima, lo que supone una disminución significativa en el coste de producción de la mencionada enzima inmovilizada. De esta forma, el procedimiento tal como se describe en esta solicitud de patente permite extender el uso de enzimas, en particular lipasas, en el mercado a gran escala. Adicionalmente, el procedimiento de la presente invención revaloriza el residuo agroalimentario utilizado como material de partida, lo que redunda en un mayor beneficio económico y medioambiental.

La inmovilización de la enzima tiene lugar principalmente por interacciones de la cadena polipeptídica con el soporte mediante, por ejemplo, puentes de hidrógeno e interacciones de van der Waals. Por lo tanto, en principio cualquier proteína y, por ende cualquier enzima, es susceptible de ser adsorbida en el soporte renovable obtenido en la etapa a) del procedimiento de la presente invención.

Para que el procedimiento de inmovilización resulte efectivo, el residuo agroalimentario se ha de someter a tratamiento térmico, es decir, se ha de calentar el residuo agroalimentario que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en sílice, óxido de catión alcalino, óxido de catión alcalinotérreo y mezcla de los anteriores, preferiblemente a una temperatura igual o superior a 500°C.

Tras el tratamiento térmico el soporte renovable posee, en comparación con el material sin dicho tratamiento térmico, una mayor homogeneidad y una mayor estabilidad mecánica y química (S.F. DSouza, S.S. Godbole J. Biochem. Biophys. Methods 52 (2002) 59-62).

En una realización preferida, la etapa a) del procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada de la presente invención comprende calentar el residuo agroalimentario entre 500 y 700 °C. En una realización aún más preferida, el calentamiento tiene lugar al aire, a una velocidad de 5°C /min.

En otra realización aún más preferida, una vez alcanzada la temperatura final entre 500 y 700 °C se mantiene durante un tiempo entre 2 y 4 horas.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere al procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada tal como se describe en esta solicitud de patente, donde la enzima es una lipasa. Preferiblemente, una lipasa del hongo Rhizopus oryzae o Candida antárctica, en ambos casos dicha lipasa puede ser nativa o recombinante.

En una realización aún más preferida, la lipasa inmovilizada en el procedimiento de la presente invención es la lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ ID N° 1). Esta enzima puede expresarse en un microorganismo tal como, por ejemplo, Pichia pastoris, Saccharomyces cerivisiae o Aspergillus niger. Preferiblemente, la lipasa inmovilizada es una lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ ID N° 1)...

1. Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada en un soporte, caracterizado porque comprende:

a) obtener un soporte renovable por tratamiento térmico de un residuo agroalimentario que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en sílice, óxido de catión alcalino, óxido de catión alcalinotérreo y mezcla de los anteriores, e

b) inmovilizar la enzima en el soporte obtenido en la etapa anterior.

2. Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada según la reivindicación 1, donde el tratamiento térmico de la etapa a) comprende calentar el residuo agroalimentario entre 500 y 700 °C

3. Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la enzima es una lipasa.

4. Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada según la reivindicación 3, donde la lipasa es una lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ ID N° 1).

5. Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el residuo agroalimentario es cáscara de arroz.

6. Procedimiento de obtención de una enzima inmovilizada según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la etapa de inmovilización comprende:

b1) obtener una disolución de la enzima en tampón fosfato 0,01 y 0,5 M a pH entre 4,5 y 8,5, b2) mezclar la disolución de la enzima preparada en la etapa b1) con el soporte renovable, b3) agitar la suspensión entre 4 y 25 °C a no más de 100 rpm, hasta que la cantidad de enzima soportada varíe menos de 2 % entre dos medidas consecutivas, b4) filtrar y lavar la enzima inmovilizada con el tampón fosfato utilizado en la etapa b1).

7. Soporte renovable caracterizado porque comprende entre 40 y 45 % en peso de silicio, presenta estructura amorfa, mesoporosa, y un tamaño de partícula medio inferior o igual a 200 mieras.

8. Soporte renovable según la reivindicación 7, obtenido por tratamiento térmico entre 500 y 700 °C de cáscara de arroz.

9. Enzima inmovilizada en un soporte renovable, caracterizada porque el soporte renovable se describe tal como se indica en una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8.

10. Enzima inmovilizada en un soporte renovable según la reivindicación 9, donde la enzima es lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ ID N° 1).

11. Uso de un residuo agroalimentario para obtener el soporte renovable tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8.

12. Uso de un residuo agroalimentario según la reivindicación 11, donde dicho residuo es cáscara de arroz.

13. Método de obtención de biodiesel que comprende:

i) obtener una lipasa recombinante del hongo Rhizopus oryzae (SEQ N° 1) inmovilizada en un soporte renovable tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, y

ii) poner en contacto la lipasa inmovilizada obtenida en la etapa anterior con un triglicérido en presencia de un alcohol seleccionado del grupo que consiste en metanol y etanol para obtener biodiesel.