Nuevos ARNip y métodos de uso de los mismos.

Un compuesto ARN de doble cadena que tiene la estructura:

5' (N)x - Z 3' (cadena antisentido)

3' Z'- (N')y 5' (cadena sentido)

en donde cada N y N' es un ribonucleótido que puede ser modificado o no modificado en su residuo azúcar;

en donde cada uno de (N), y (N')y es un oligonucleótido en el cual cada N o N' consecutivo se une al siguiente N o N' por un enlace covalente;

en donde cada uno de x e y es un entero entre 19 y 40;

en donde cada uno de Z y Z ' puede estar presente o ausente, pero si está presente es 1-5 nucleótidos consecutivos unidos covalentemente en el extremo 3' de la cadena en la que está presente, y en donde la secuencia de (N)x comprende sec. con núm. de ident.: 140 y la secuencia de (N')y comprende sec. con núm. de ident.: 139.

Nuevos ARNip y métodos de uso de los mismos Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos núm. 60/854, 503 presentada el 25 de octubre de 2006, y de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos núm. 60/930, 493 presentada el 15 de mayo de 2007.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas que los comprende y sus usos para la inhibición de ciertos genes, incluyendo los genes pro-apoptóticos. Los compuestos y composiciones así son útiles en el tratamiento de individuos que sufren de enfermedades o afecciones y o síntomas asociados con dichas enfermedades o afecciones en las que la expresión génica tiene consecuencias adversas En modalidades particulares, la invención proporciona los oligonucleótidos de ARNip, las composiciones que los comprenden y sus usos en el tratamiento de la insuficiencia renal aguda (ARF) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

ARNip y ARN de interferencia La interferencia por ARN (iARN) es un fenómeno que involucra el silenciamiento postraduccional gen-específico dependiente del ARN de cadena doble (bc) . Los intentos iniciales de estudiar este fenómeno y manipular experimentalmente las células de mamíferos se frustraron mediante un mecanismo de defensa antiviral activo y no-específico que se activó en respuesta a largas moléculas de ARNbc (Gil y otros, Apoptosis, 2000. 5:107-114) . Después, se descubrió que ARNs de cadenas dobles sintéticas de 21 nucleótidos podían mediar el iARN específico al gen en células de mamíferos, sin estimular los mecanismos genéricos de defensa antiviral Elbashir y otros, Nature 2001, 411:494-498 y Caplen y otros, PNAS 2001, 98:9742-9747) . Como resultado, los ARNs pequeños de interferencia (ARNip) , que son ARNs de cadenas dobles cortas, se han usado ampliamente para inhibir la expresión génica y comprender la función génica.

La interferencia por ARN (iARN) es mediada por pequeños ARNs de interferencia (ARNips) (Fire y otros, Nature 1998, 391:806) o microARNs (miARNs) (Ambros V. Nature 2004, 431:350-355) ; y Bartel DP. Cell. 2004 116 (2) :281-97) . El proceso correspondiente se denomina comúnmente como silenciamiento génico post-transcripcional específico como cuando observado en plantas y como extinción cuando observado en hongos.

Un ARNip es un ARN de cadena doble que regula descendente o silencia (es decir, inhibe completamente o parcialmente) la expresión de un gen/ARNm endógeno o exógeno. La interferencia por ARN se basa en la capacidad de ciertas especies de ARNbc para entrar en un complejo de proteína específica, donde se dirigen después a los ARN celulares complementarios y los degradan específicamente. Así, la respuesta de la interferencia por ARN caracteriza un complejo de endonucleasa que contiene un ARNip, comúnmente denominado como un complejo silenciador inducido por ARN (RISC) , que media la escisión del ARN de cadena sencilla que tiene la secuencia complementaria a la cadena antisentido del ARNip de cadena doble. La escisión del ARN objetivo puede ocurrir en el medio de la región complementaria a la cadena antisentido del ARNip de cadena doble (Elbashir, y otros, Genes Dev., 2001, 15:188) . En más detalle, los ARNbc más largos se digieren en fragmentos de ARNbc cortos (17-29 pb) ARNbc (denominados además como ARN inhibidores cortos o "ARNips") por ARNasas tipo III (DICER, DROSHA, etc., (verBernstein y otros, Nature, 2001, 409:363-6 y Lee y otros, Nature, 2003, 425:415-9) . El complejo de proteína RISC reconoce estos fragmentos y el ARNm complementario. El proceso completo se culmina por la escisión de la endonucleasa del ARNm objetivo (McManus y Sharp, Nature Rev Genet, 2002, 3:737-47; Paddison y Hannon, Curr Opin Mol Ther. 2003, 5 (3) : 217-24) . (Para información adicional en estos términos y mecanismos propuestos, ver por ejemplo, Bernstein, y otros, RNA. 2001, 7 (11) :1509-21; Nishikura, Cell. 2001, 107 (4) :415-8 y publicación PCT núm. WO 01/36646) .

Los estudios revelaron que ARNip puede ser eficaz in vivo tanto en mamíferos como humanos. Específicamente, Bitko y otros, mostraron que los ARNip específicos dirigidos contra el gen de la nucleocápsida N del virus sincitial respiratorio (RSV) son eficaces en el tratamiento de los ratones cuando se administran por vía intranasal (Bitko y otros, Nat. Med. 2005, 11 (1) :50-55) . Para revisiones de las aplicaciones terapéuticas de ARNip ver Barik (Mol. Med 2005, 83: 764-773) y Chakraborty (Current Drug Targets 2007 8 (3) :469-82) . Adicionalmente, se han realizado estudios clínicos con ARNip cortos que se dirigen al receptor VEGFR1 para tratar la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) en pacientes humanos. En estudios tal ARNip administrado por inyección intravítrea (intraocular) se encontró eficaz y seguro en los 14 pacientes analizados (Kaiser, Am J Ophthalmol. 2006 142 (4) :660-8) .

Genes pro-apoptóticos Los genes pro-apoptóticos generalmente se definen como genes que juegan un papel en la muerte celular apóptotica. Genes pro-apoptóticos, útiles en la presente invención incluyen caspasa 2, peptidasa cisteína asociada a la apoptosis (CASP2) .

Pérdida de audición:

Ototoxicidad inducida por sustancias químicas Los efectos ototóxicos de varios fármacos terapéuticos en células auditivas y las neuronas del ganglio espiral son frecuentemente el factor que limita su utilidad terapéutica. Fármacos ototóxicos usados comúnmente incluyen el ampliamente usado agente quimioterapéutico cisplatina y sus análogos, antibióticos de aminoglucósidos, por ejemplo, gentamicina, quinina y sus análogos, salicilato y sus análogos, y diuréticos del asa.

Por ejemplo, se sabe que los aminoglucósidos antibacterianos tales como gentamicina, estreptomicina, kanamicina, tobramicina, y similares, tienen efectos secundarios tóxicos graves, particularmente ototoxicidad y nefrotoxicidad, que reducen su valor como agentes terapéuticos (ver Goodman y Gilman The Pharmacological Basis of Therapeutics, 6ta edición, A. Goodman Gilman y otros, incluye caspasa 2, cisteína peptidasa asociada a la apoptosis (CASP2) . eds; Macmillan Publishing Co., Inc., 1980. Nueva York, págs. 1169-71) . Así, la ototoxicidad es un efecto secundario dosis-limitante reconocido de la administración de antibióticos. Los estudios han demostrado que de 4 a 15% de los pacientes que reciben un gramo por día durante más de una semana desarrollan pérdida de audición medible, que empeora gradualmente y puede conducir a la sordera permanente si continúa el tratamiento.

La ototoxicidad es además un efecto secundario grave dosis-limitante para la cisplatina, un complejo de coordinación de platino, que ha demostrado ser eficaz en una variedad de cánceres humanos incluyendo el cáncer testicular, ovárico, vejiga, y de cabeza y cuello. La cisplatina (Platinol®) daña los sistemas auditivos y vestibulares. Los salicilatos, tal como la aspirina, son los fármacos más comúnmente usados debido a sus efectos anti-inflamatorios, analgésicos, antipiréticos y antitrombóticos. Desafortunadamente, ellos también tienen efectos secundarios ototóxicos incluyendo silbido ("zumbido en los oídos") y pérdida temporal de la audición. Además, si el medicamento se usa en dosis altas durante un tiempo prolongado, el deterioro auditivo puede volverse persistente e irreversible.

Sin estar limitados por la teoría, se cree que los fármacos cisplatina y otros fármacos potencialmente ototóxicos inducen los efectos ototóxicos través de la apoptosis en el tejido del oído interno, particularmente las células ciliadas del oído interno (Zhang y otros, Neuroscience 2003, 120 (1) :191-205; Wang y otros, J. Neuroscience, 2003, 23 (24) :8596-8607) . En mamíferos, las células ciliadas auditivas sólo se producen durante el desarrollo embrionario y en caso de pérdida no se regeneran durante la vida después del nacimiento. Por lo tanto, una pérdida de células ciliadas se traducirá en la sordera profunda e irreversible. Desafortunadamente, actualmente no hay terapias eficaces para tratar la cóclea y revertir esta condición. Así, una terapia eficaz para prevenir la muerte celular de las células ciliadas auditivas puede ser de gran valor terapéutico. La solicitud de patente de Estados Unidos núm. de serie 11/655, 610, asignada al solicitante de la presente invención se refiere a los métodos para tratar el deterioro de la audición en un sujeto que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad eficaz de un inhibidor del polinucleótido p53, y opcionalmente un inhibidor de un gen pro-apoptótico.

Presbiacusia Otro tipo de pérdida de la audición es la presbiacusia, que es pérdida de la audición que ocurre... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto ARN de doble cadena que tiene la estructura:

5' (N) x - Z 3' (cadena antisentido)

3' Z'- (N') y 5' (cadena sentido)

5

en donde cada N y N' es un ribonucleótido que puede ser modificado o no modificado en su residuo azúcar;

en donde cada uno de (N) , y (N') y es un oligonucleótido en el cual cada N o N' consecutivo se une al siguiente N o N' por un enlace covalente;

10 en donde cada uno de x e y es un entero entre 19 y 40; en donde cada uno de Z y Z ' puede estar presente o ausente, pero si está presente es 1-5 nucleótidos consecutivos

unidos covalentemente en el extremo 3' de la cadena en la que está presente, y en donde la secuencia de (N) x comprende sec. con núm. de ident.: 140 y la secuencia de (N') y comprende sec. con núm. de ident.: 139.

15 2. Un compuesto ARN de doble cadena que tiene la estructura:

5' AGGAGUUCCACAUUCUGGC 3' (cadena antisentido) (sec. con núm. de ident.: 140)

3' UCCUCAAGGUGUAAGACCG 5' (cadena sentido) (sec. con núm. de ident.:139)

en donde cada A, C, G, y U es un ribonucleótido que puede ser modificado o no modificado en su residuo azúcar; y en donde cada ribonucleótido consecutivo se une al siguiente ribonucleótido por un enlace covalente.

3. El compuesto de la reivindicación 1 o 2, en donde el enlace covalente que une cada ribonucleótido consecutivo es un enlace fosfodiéster.

4. El compuesto de la reivindicación 1, en donde x = y y preferentemente x=y= 19.

5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en donde al menos un ribonucleótido comprende una modificación en su residuo azúcar.

6. El compuesto de la reivindicación 5, en donde la modificación comprende una modificación en la posición 2', dicha modificación comprende preferentemente la presencia de un grupo amino, un fluoro, un alcoxi o un alquilo.

7. El compuesto de la reivindicación 6, en donde la modificación comprende la presencia de un grupo alcoxi que es un grupo metoxi (2'-O-metilo) .

8. El compuesto de la reivindicación 1 o 2, en donde alternar los ribonucleótidos en la cadena antisentido y/o la cadena 35 sentido se modifican en sus residuos azúcar.

9. El compuesto de la reivindicación 8, en donde cada ribonucleótido en los terminales 5' y 3' de la cadena antisentido está modificado en su residuo azúcar, y cada ribonucleótido en los terminales 5' y 3' de la cadena sentido no está modificado en su residuo azúcar.

10. El compuesto de la reivindicación 9, en donde la cadena antisentido y la cadena sentido no están fosforiladas en su terminal 3' y terminal 5' o en donde la cadena antisentido y la cadena sentido son fosforiladas en su terminal 3'.

11. El compuesto de la reivindicación 7, en donde un grup.

2. O-metilo está presente en el primer, tercer, quinto,

séptimo, noveno, onceno, decimotercer, decimoquinto, decimoséptimo y decimonoveno nucleótido de la cadena antisentido, y en donde un grup.

2. O-metilo está presente en el segundo, cuarto, sexto, octavo, décimo, duodécimo, decimocuarto, decimosexto y decimooctavo nucleótidos de la cadena sentido.

12. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y un 50 portador farmacéuticamente aceptable.

13. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para usar en terapia.

14. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para usar en el tratamiento de una lesión por isquemiareperfusión, en donde la lesión por isquemia-reperfusión es insuficiencia renal aguda (ARF) .