Nuevo aparato y procedimiento de recubrimiento de sustratos portadores para la detección de analitos mediante un procedimiento de detección por afinidad.

Aparato para el recubrimiento de sustratos portadores para la detección de uno o varios analitos en un procedimiento de detección por afinidad que comprende:

- un recipiente cerrado (1) excepto por opcionales entradas de gas (5) y salidas de gas (6) para alojar un líquido (7) que se va a nebulizar que contiene sustancias que se van a depositar sobre al menos una superficie de dichos sustratos portadores así como un volumen de niebla generado sobre el líquido en estado de funcionamiento,

- un actuador (3) para originar el proceso de nebulización sumergido en el líquido (7) que se va a nebulizar por debajo de un

- soporte (2), estando el soporte en el volumen de niebla generado en el recipiente cerrado y no estando el sustrato portador en contacto con la superficie del líquido que se va a nebulizar, caracterizado porque el soporte sirve para alojar horizontalmente, con respecto a la superficie del líquido que se va a nebulizar, y mantener los sustratos portadores durante el proceso de recubrimiento

Nuevo aparato y procedimiento de recubrimiento de sustratos portadores para la detección de analitos mediante un procedimiento de detección por afinidad

Antecedentes técnicos de la invención

Para numerosos sectores de aplicación es necesario determinar una multiplicidad de analitos en una muestra de composición y naturaleza eventualmente complejas, por ejemplo en procedimientos de diagnóstico para determinar el estado de salud de un individuo o en la investigación y el desarrollo en el sector farmacéutico para determinar la influencia de un organismo y el modo de acción complejo del mismo mediante el suministro de compuestos biológicamente activos.

Mientras que los procedimientos de separación analíticos conocidos están, en general, optimizados para separar dentro de un periodo de tiempo lo más corto posible un número lo más elevado posible de compuestos presentes en una muestra dada según un parámetro físico-químico predefinido, tal como, por ejemplo el peso molecular o el cociente entre carga molecular y masa, los procedimientos de detección por bioafinidad se basan en, en cada caso, un elemento de reconocimiento biológico o bioquímico o sintético con la especificidad más elevada posible, en adelante denominado también "asociado de unión" o "asociado de unión específico", para reconocer el analito correspondiente (individual) y unirse al mismo en una muestra de composición compleja de un modo altamente selectivo. La detección de una multiplicidad de compuestos diferentes requiere, por lo tanto, del uso de un número correspondiente de diferentes elementos de reconocimiento específicos.

Un procedimiento de detección basado en reacciones de bioafinidad puede realizarse tanto en una solución homogénea como también en la superficie de un soporte sólido ("sustrato portador"). Según el diseño específico del procedimiento, después de la unión del analito al elemento de reconocimiento correspondiente y, dado el caso, otras sustancias de detección, así como, dado el caso, entre distintas etapas del procedimiento, es necesaria en cada caso una etapa de lavado, para separar los complejos formados de los elementos de reconocimiento y los analitos que se van a detectar, así como dado el caso otras sustancias de detección del resto de la muestra y de los reactivos adicionales dado el caso usados.

Para determinar una multiplicidad de analitos o analizar una pluralidad de muestras se han extendido, sobre todo en laboratorios analíticos industriales, procedimientos en los que se realiza en las denominadas mlcroplacas de valoración la detección de distintos analitos en recipientes de muestra discretos o "pocilios" de estas placas. A este respecto, las más extendidas son placas con un patrón de 8 x 12 pocilios sobre una superficie básica de, típicamente, aproximadamente 8 cm x 12 cm, siendo necesario para el llenado de un pocilio Individual un volumen de algunos cientos de microlitros. Para numerosas aplicaciones sería deseable, no obstante, determinar simultáneamente varios analitos en un único recipiente de muestra usando un volumen de muestra lo más reducido posible.

En los documentos WO 84/131, US-P 587755, US-P5837.551 y US-P 5432.99 se propone la Inmovilización de elementos de reconocimiento específicos de los analitos en forma de "puntos de detección" pequeños como zonas de medición discretas con superficies que parcialmente son claramente Inferiores a 1 mm2 sobre un sustrato portador conjunto, para poder realizar, mediante la unión de solo una pequeña porción de moléculas de analito presentes, una determinación de la concentración del analito que es dependiente solo del tiempo de incubación, pero que es, en ausencia de un flujo continuo, esencialmente Independiente del volumen de muestra absoluto. Una multiplicidad de dichos "puntos de detección" como zonas de medición representa en una disposición bldimensional sobre un sustrato portador conjunto una denominada "mlcroserle".

Mientras tanto, los procedimientos para detectar simultáneamente una multiplicidad de ácidos nucleicos diferentes en una muestra usando ácidos nucleicos correspondientes complementarlos Inmovilizados sobre un sustrato portador en zonas de medición discretas separadas espacialmente como elementos de reconocimiento, están extendidos de forma relativamente amplia. Por ejemplo, se conocen disposiciones de ollgonucleótidos como elementos de reconocimiento, basados en placas sencillas de vidrio o de microscopio como sustratos portadores, con una densidad característica muy alta (densidad de zonas de medición sobre un soporte sólido conjunto). Por ejemplo, en el documento de patente de Estados Unidos N° 5.445.934 (Affymax Technologies) se describen y se reivindican oligonucleótidos con una densidad superior a 1 características por centímetro cuadrado.

Desde hace poco tiempo se han vuelto también más frecuentes descripciones de disposiciones y procedimientos de detección llevados a cabo con las mismas de un tipo similar para la determinación simultánea de una multiplicidad de proteínas, por ejemplo en el documento de patente de Estados Unidos N° 6.365.418 B1.

La forma más sencilla de inmovilización del asociado de unión para la detección de analitos consiste en la adsorción física, por ejemplo debido a interacciones hidrófobas entre el asociado de unión y el sustrato portador. La magnitud de estas interacciones, sin embargo, puede alterarse intensamente debido a la composición del medio y a sus propiedades físico-químicas, por ejemplo la polaridad y la fuerza iónica. En particular en el caso de la adición secuencial de distintos reactivos en un ensayo de varias etapas, la capacidad adhesiva del asociado de unión después de una inmovilización puramente por adsorción sobre la superficie es a menudo insuficiente.

Por lo tanto, a menudo es preferente inmovilizar el asociado de unión a una capa promotora de la adhesión aplicada al sustrato portador. Se sabe que son adecuados para la producción de la capa promotora de la adhesión una multiplicidad de materiales, por ejemplo silanos no funcionalizados o funcionalizados, epóxidos, polímeros funcionalizados, cargados o polares y "monocapas o capas múltiples autoorganizadas, pasivas o funcionalizadas", fosfatos y fosfonatos de alquilo, copolímeros de bloque multifuncionales, tales como, por ejemplo, poli(L)lis¡na/polietilenglicoles.

Por ejemplo, en el documento WO /65352 se describen recubrimientos de plataformas sensoras bioanalíticas o implantes para aplicaciones médicas como sustratos portadores con copolímeros de injerto como capas promotoras de la adhesión, con una cadena principal poliiónica, por ejemplo unida a un sustrato portador (electrostáticamente) y cadenas laterales "no interactivas" (resistentes a la adsorción).

Para minimizar la unión no específica de analitos o sus sustancias de detección u otros asociados de unión, en particular en las zonas (no cubiertas) entre las zonas de medición (puntos de detección (spots)) generadas mediante la aplicación dirigida de forma local para la detección de analitos, es muchas veces preferente pasivar estas zonas. Para ello se aplican entre las zonas de medición separadas espacialmente sobre los sustratos de soporte compuestos que son "químicamente neutros" con respecto a los analitos o a sus sustancias de detección o a otros asociados de unión, es decir, que no se unen a los mismos.

Dichos componentes que son "químicamente neutros" con respecto a los analitos o sus sustancias de detección u otros asociados de unión, es decir, que no se unen a los mismos, (en adelante denominados también "compuestos de pasivación") pueden seleccionarse de un modo conocido de los grupos formados por albúminas, en particular albúminas de suero bovino o albúmina de suero humano, caseína, anticuerpos no específicos, policlonales o monoclonales, heterólogos o empíricamente no específicos para el o los analitos que se van a detectar (en particular para inmunoensayos), detergentes, tales como, por ejemplo, Tween 2, ADN fragmentado natural o sintético que no se híbrida con los polinucleótidos que se van a analizar, tal como, por ejemplo, un extracto de esperma de arenque o de salmón (en particular para ensayos de hibridación de polinucleótidos), o también polímeros no cargados, pero hidrófilos, tales como, por ejemplo, polietilenglicoles o dextranos.

Para posibilitar la generación de datos cuantificables de una forma fiable a partir de las señales de unión, por ejemplo usando detección de fluorescencia, de distintas zonas de medición (puntos de detección) de una microserie, es necesario garantizar una densidad superficial uniforme y una actividad de unión del asociado de unión inmovilizado en zonas de medición que se van a comparar... [Seguir leyendo]

1. Aparato para el recubrimiento de sustratos portadores para la detección de uno o varios analitos en un procedimiento de detección por afinidad que comprende:

- un recipiente cerrado (1) excepto por opcionales entradas de gas (5) y salidas de gas (6) para alojar un liquido (7) que se va a nebulizar que contiene sustancias que se van a depositar sobre al menos una superficie de dichos sustratos portadores asi como un volumen de niebla generado sobre el líquido en estado de funcionamiento,

- un actuador (3) para originar el proceso de nebulización sumergido en el líquido (7) que se va a nebulizar por debajo de un

- soporte (2), estando el soporte en el volumen de niebla generado en el recipiente cerrado y no estando el sustrato portador en contacto con la superficie del líquido que se va a nebulizar, caracterizado porque el soporte sirve para alojar horizontalmente, con respecto a la superficie del líquido que se va a nebulizar, y mantener los sustratos portadores durante el proceso de recubrimiento.

2. Aparato según la reivindicación 1, caracterizado porque el actuador mencionado en el estado de funcionamiento está sumergido en líquido que se va a nebulizar.

3. Aparato según una de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque este comprende adlclonalmente un separador de gotas.

4. Aparato según la reivindicación 3, caracterizado porque el separador de gotas permite el paso de gotas hasta un tamaño definido y comprende una red de malla fina con cuyo tamaño de malla se determina el tamaño máximo de las gotas que pasan a su través.

5. Aparato según una de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque este adicionalmente comprende medios para generar una distribución uniforme de la niebla generada y que se va a depositar sobre los sustratos portadores en el entorno de dichos sustratos portadores.

6. Aparato según una de las reivindicaciones 1 - 5, caracterizado porque este adicionalmente comprende medios para controlar y/o regular la temperatura del líquido que se va a nebulizar y/o de algunas o de todas las paredes del recipiente del líquido.

7. Aparato según una de las reivindicaciones 1 - 6, caracterizado porque el soporte del aparato de recubrimiento para alojar y/o mantener el sustrato portador durante el proceso de recubrimiento puede termostatlzarse.

8. Procedimiento de recubrimiento de sustratos portadores para la detección de uno o varios analitos en un procedimiento de detección por afinidad, caracterizado porque

- dichos sustratos portadores que se van a recubrir están dispuestos en un soporte de un aparato de recubrimiento según una de las reivindicaciones 1-7,

- el líquido contenido en el recipiente para líquidos de dicho aparato de recubrimiento se nebuliza y

- se realiza una deposición de las sustancias contenidas en el líquido nebullzado a partir de la niebla generada sobre los sustratos portadores que se van a recubrir,

no encontrándose los sustratos portadores en contacto con la superficie del líquido que se va a nebulizar.

9. Sustrato portador para la detección de uno o varios analitos en un procedimiento de detección por afinidad, siendo el sustrato portador plano, que comprende zonas de medición separadas espacialmente aplicadas sobre el sustrato portador usando una capa promotora de la adhesión aplicada al sustrato portador o directamente, estando cubiertas las zonas libres entre las zonas de medición y dentro de las mismas con una capa de pasivación, caracterizado porque dicha capa de pasivación se ha generado con un procedimiento de recubrimiento según la reivindicación 8.