Nueva celulasa 029cel de Bacillus.

Un polinucleótido aislado, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad secuencial de al menos 85% con respecto a la ID. SEC. nº 1, o el complemento de la misma;

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica, o es complementaria de una secuencia que codifica, un polipéptido 029cel que tiene una identidad secuencial de al menos 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3;

(c) una secuencia de ácido nucleico que codifica, o es complementaria de una secuencia que codifica, un polipéptido 029cel que tiene una identidad secuencial de al menos 90% con respecto a la secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3;

(d) una secuencia de ácido nucleico que codifica, o es complementaria de una secuencia que codifica, un polipéptido 029cel que tiene una identidad secuencial de al menos 95% con respecto a la secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3; y

(e) una secuencia de ácido nucleico que codifica, o es complementaria de una secuencia que codifica, un polipéptido 029cel que tiene la secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3;

en donde dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido que tiene la actividad biológica de una celulasa y en donde la identidad se determina mediante el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, ejecutado con los parámetros por omisión que incluyen una penalización por hueco abierto de 10,0, una penalización por hueco extendido de 0,1 y una matriz de similitudes BLOSUM 30.

Nueva celulasa 029cel de Bacillus Campo de la invención Esta invención se refiere a una nueva celulasa a la que se hace referencia en esta memoria como 029cel. También se describen ácidos nucleicos que codifican la celulasa, composiciones que comprenden dicha celulasa, métodos para identificar nuevas celulasas y métodos para utilizar dichas composiciones. Preferiblemente, la (s) celulasa (s) se aísla (n) de especies del género Bacillus, preferiblemente de B. agaradhaerens. La presente invención se refiere además al uso de la nueva celulasa en composiciones reconocidas en la técnica como ventajosas por tener una celulasa añadida a ellas, incluyendo como un aditivo en una composición detergente, en el tratamiento de tejidos que contienen celulosa, en el tratamiento de pulpa y papel y en el tratamiento de almidón para la producción de etanol o jarabe de maíz con alto contenido de fructosa.

Antecedentes de la invención La celulosa y la hemicelulosa son los más abundantes materiales vegetales producidos por fotosíntesis. Pueden ser degradadas y empleadas como fuente de energía por numerosos microorganismos, incluyendo bacterias, levaduras y hongos, que producen enzimas extracelulares capaces de la hidrólisis de los sustratos poliméricos hasta azúcares monoméricos (aro et al., 2001) . Puesto que nos aproximamos a los límites de los recursos no renovables, el potencial de la celulosa para llegar a ser un importante recurso energético renovable es enorme (Krishna et al., 2001) . La utilización eficaz de la celulosa a través de procesos biológicos es un planteamiento para superar la escasez de alimentos, piensos y combustibles (Ohmiya et al. 1997) .

Las celulasas son enzimas que hidrolizan celulosa (enlaces beta-1, 4-glucano o beta-D-glucosídicos) para dar lugar a la formación de glucosa, celobiosa, celo-oligosacáridos y similares. Las celulasas han sido tradicionalmente divididas en tres clases principales: endoglucanasas (EC 3.2.1.4) ("EG") , exoglucanasas o celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) ("CBH") y beta-glucosidasas ([beta]-D-glucósido glucohidrolasa; EC 3.2.1.21) ("BG") (Knowles et al., 1987; Shulein, 1988) . Las endoglucanasas actúan principalmente sobre las partes amorías de la fibra de celulosa, mientras que las celobiohidrolasas también son capaces de degradar la celulosa cristalina (Nevalainen y Penttila, 1995) . Por lo tanto, para la solubilización eficaz de la celulosa cristalina se necesita la presencia de una celobiohidrolasa en un sistema de celulasas (Suurnakki et al., 2000) . La beta-glucosidasa actúa para liberar unidades de D-glucosa de la celobiosa, los celo-oligosacáridos y otros glucósidos (Freer, 1993) .

Con objeto de convertir eficazmente la celulosa cristalina en glucosa, se requiere el sistema de celulasas completo que comprende componentes de cada una de las clasificaciones CBH, EG y BG, con componentes aislados menos eficaces en cuanto a hidrolizar la celulosa cristalina (Filho et al., 1996) . Se ha observado una relación sinérgica entre los componentes de celulasa de las diferentes clasificaciones. En particular, las celulasas de tipo EG y las celulasas de tipo CBH interaccionan sinérgicamente para degradar más eficazmente la celulosa. Véase, por ejemplo, Wood, 1985.

Aunque se han descrito previamente composiciones de celulasa, persiste la necesidad de nuevas y mejoradas composiciones de celulasa para uso en detergentes domésticos, composiciones para lavado a la piedra o detergentes para la colada, etcétera. Son particularmente interesantes las celulasas que presentan unas cualidades mejoradas.

Breve sumario de la invención Un objeto de la presente invención es proporcionar una nueva celulasa que tenga propiedades beneficiosas para uso en detergentes, el tratamiento de textiles, la conversión de biomasa y la fabricación de pulpa y papel.

Un objeto de la presente invención es proporcionar polipéptidos que tengan actividad celulolítica y polinucleótidos que codifiquen los polipéptidos. Los polipéptidos pueden mejorar la degradación del material de la pared celular, por ejemplo, la celulosa y/o la hemicelulosa. Los polipéptidos pueden también mejorar la estabilidad o actividad de otras enzimas implicadas en la degradación del material de la pared celular de plantas, por ejemplo, la biomasa.

Un objeto de la presente invención es proporcionar una nueva celulasa y derivados de la misma, métodos para producir dichas celulasas, y composiciones que comprendan dichas nuevas celulasas. La presente invención se refiere además al uso de la nueva celulasa y derivados de la misma en composiciones reconocidas en la técnica como ventajosas por tener una celulasa añadida a ellas, incluyendo como un aditivo en una composición detergente, en el tratamiento de textiles tales como tejidos que contienen celulosa y fibras útiles para los mismos, como un aditivo para pienso para animales, en la conversión de biomasa, en el tratamiento de pulpa y papel y en el tratamiento de almidón para la producción de etanol o jarabe de maíz con alto contenido de fructosa.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para producir una nueva celulasa a través de la expresión heteróloga desde células huésped recombinantes.

Aún otro objeto de la presente invención es proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifique la celulasa de la invención. En un aspecto, el ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos facilitan la producción comercial de la nueva celulasa y las composiciones de celulasa de la invención.

Aún otro objeto de la presente invención es proporcionar una nueva celulasa que tenga unas propiedades excelentes para uso en detergentes, el tratamiento de textiles, como un suplemento para pienso y en la fabricación de pulpa y papel. En un aspecto más, la celulasa resulta útil en la conversión de biomasa.

En un primer aspecto, la invención incluye un polinucleótido aislado que tiene una secuencia que codifica 029cel, una secuencia complementaria de la secuencia de codificación del gen 029cel, y una composición que comprende el polinucleótido. El polinucleótido puede ser mRNA, DNA, cDNA, DNA genómico, o un análogo antisentido de los mismos.

En una realización, un polinucleótido 029cel puede comprender una molécula de ácido nucleico aislada que se hibrida con el complemento del ácido nucleico presentado como ID. SEC. nº 2 bajo condiciones de rigor moderado a alto, donde la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido 029cel que presenta actividad ligante de celulosa.

El polinucleótido que tiene una identidad secuencial de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más con respecto a la secuencia presentada como ID. SEC. nº 2 puede codificar una proteína 029cel. En una realización específica, el polinucleótido comprende una secuencia sustancialmente idéntica a la ID. SEC. nº 2.

En un segundo aspecto, se proporciona una nueva celulasa o un derivado que son obtenibles de una especie de Bacillus. Preferiblemente, la celulasa de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la Figura 3 (ID. SEC. nº 3) , o un derivado de la misma, que tiene una identidad secuencial superior al 90%, preferiblemente una identidad secuencial superior a 95% y más preferiblemente una identidad secuencial superior al 97% con respecto a una porción activa de la misma.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos, que codifica el polipéptido de la invención, operativamente unida a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado.

La invención proporciona además vectores de expresión recombinantes que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica 029cel o una variante de la misma por ayuste, operativamente unida a elementos reguladores eficaces para la expresión de la proteína en un huésped seleccionado. En un aspecto relacionado, la invención incluye una célula huésped que contiene el vector.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico de la invención.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico de la invención.

La invención incluye además un método para producir 029cel mediante técnicas recombinantes, mediante el cultivo de células huésped procarióticas o eucarióticas recombinantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica 029cel bajo unas condiciones eficaces para promover la expresión de la proteína, y la recuperación posterior de la proteína... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido aislado, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad secuencial de al menos 85% con respecto a la ID. SEC. nº 1, o el complemento de la misma;

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica, o es complementaria de una secuencia que codifica, un polipéptido 029cel que tiene una identidad secuencial de al menos 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3;

(c) una secuencia de ácido nucleico que codifica, o es complementaria de una secuencia que codifica, un polipéptido 029cel que tiene una identidad secuencial de al menos 90% con respecto a la secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3;

(d) una secuencia de ácido nucleico que codifica, o es complementaria de una secuencia que codifica, un polipéptido 029cel que tiene una identidad secuencial de al menos 95% con respecto a la secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3; y

(e) una secuencia de ácido nucleico que codifica, o es complementaria de una secuencia que codifica, un polipéptido 029cel que tiene la secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3;

en donde dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido que tiene la actividad biológica de una celulasa y en donde la identidad se determina mediante el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, ejecutado con los parámetros por omisión que incluyen una penalización por hueco abierto de 10, 0, una penalización por hueco extendido de 0, 1 y una matriz de similitudes BLOSUM 30.

2. Un polinucleótido aislado, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de ácido nucleico ID. SEC. nº 1, o el complemento de la misma;

(b) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida, bajo condiciones de rigor elevado, con la secuencia ID. SEC. nº 1, o el complemento de la misma;

(c) una secuencia de ácido nucleico ID. SEC. nº 2, o el complemento de la misma; y

(d) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida, bajo condiciones de rigor elevado, con la secuencia ID. SEC. nº 2, o el complemento de la misma,

en donde dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido que tiene la actividad biológica de una celulasa y en donde la hibridación se lleva a cabo a 42 º C en formamida al 50%, SSC 6X, disolución de Denhardt 5X, SDS al 0, 5% y 100 μg/ml de DNA portador desnaturalizado, seguida de lavado dos veces en SSPE 2X y SDS al 0, 5% a temperatura ambiental y dos veces más en SSPE 0, 1X y SDS al 0, 5% a 42 º C.

3. El polinucleótido aislado de la Reivindicación 1, en donde el polinucleótido se selecciona del grupo: mRNA, DNA, cDNA, DNA genómico, y un análogo antisentido de los mismos.

4. El polinucleótido aislado de la Reivindicación 3, en donde dicho polinucleótido es una molécula de RNA.

5. El polinucleótido aislado de la Reivindicación 1 que codifica una enzima que tiene actividad celulasa, en donde la enzima es aislada de una fuente del género Trichoderma.

6. El polinucleótido aislado de la Reivindicación 5, en donde la enzima es aislada de Trichoderma reesei.

7. Una construcción de expresión que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene actividad celulasa y

(i) que tiene una identidad secuencial de al menos 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3, o

(ii) que es complementaria de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad secuencial de al menos 85% con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3,

en donde la identidad se determina mediante el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, ejecutado con los parámetros por omisión que incluyen una penalización por hueco abierto de 10, 0, una penalización por hueco extendido de 0, 1 y una matriz de similitudes BLOSUM 30.

8. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la Reivindicación 1.

9. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado de la Reivindicación 1, operativamente unido a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

10. Un vector de expresión según la Reivindicación 9, que comprende una secuencia polinucleotídica reguladora que incluye una secuencia promotora derivada de un gen de glucosa isomerasa de Actinoplanes, una secuencia señal derivada de un gen de celulasa de Streptomyces, y una secuencia polinucleotídica que codifica una celulasa 029cel.

11. Un vector que comprende la construcción de expresión de la Reivindicación 7.

12. Una célula huésped transformada con el vector de la Reivindicación 8.

13. La célula huésped de la Reivindicación 12, que es una célula procariótica.

14. La célula huésped de la Reivindicación 12, que es una célula eucariótica.

15. Un polipéptido 029cel sustancialmente purificado con la actividad biológica de una celulasa, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3;

(b) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos 90% con respecto a la secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3;

(c) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos 95% con respecto a la secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3; y

(d) una secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3;

en donde la identidad se determina mediante el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, ejecutado con los parámetros por omisión que incluyen una penalización por hueco abierto de 10, 0, una penalización por hueco extendido de 0, 1 y una matriz de similitudes BLOSUM 30.

16. El polipéptido celulasa sustancialmente purificado según la Reivindicación 15 o un derivado que es obtenible de un microorganismo del género Bacillus.

17. Un método para producir una celulasa, que comprende las operaciones de:

(a) cultivar la célula huésped según la Reivindicación 12 en un medio de cultivo adecuado bajo unas condiciones adecuadas para producir la celulasa; y

(b) obtener dicha celulasa producida.

18. El método de la Reivindicación 17, en donde la célula huésped es una célula de hongo filamentoso o levadura.

19. El método de la Reivindicación 17, en donde la célula huésped es una bacteria.

20. El método de la Reivindicación 19, en donde la bacteria es del género Streptomyces.

21. Una enzima purificada que tiene actividad celulasa, preparada mediante el método de la Reivindicación 17.

22. Un oligonucleótido antisentido complementario de un RNA mensajero que codifica un polipéptido que tiene la secuencia ID. SEC. nº 3, en donde, tras la exposición a una célula huésped que produce celulasa, dicho oligonucleótido disminuye o inhibe la producción de celulasa por dicha célula huésped.

23. El oligonucleótido antisentido de la Reivindicación 22, en donde la célula huésped es un hongo filamentoso.

24. Una composición detergente, composición que comprende un agente tensioactivo y un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3;

(b) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos 90% con respecto a la secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3;

(c) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos 95% con respecto a la secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3; y

(d) una secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 3; en donde la identidad se determina mediante el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, ejecutado con los

parámetros por omisión que incluyen una penalización por hueco abierto de 10, 0, una penalización por hueco extendido de 0, 1 y una matriz de similitudes BLOSUM 30.

25. El detergente según la Reivindicación 24, en donde dicho detergente es un detergente para la colada.

26. El detergente según la reivindicación 24, en donde dicho detergente es un detergente para la vajilla.

27. Un aditivo para pienso, que comprende una celulasa según la Reivindicación 15.

28. Un método para tratar la pulpa de madera, que comprende poner dicha pulpa de madera en contacto con una celulasa según la Reivindicación 15.

29. Un método para convertir biomasa en azúcares, que comprende poner dicha biomasa en contacto con una celulasa según la Reivindicación 15.

30. El método de la Reivindicación 29, que comprende además la generación de jarabe de maíz con alto contenido de fructosa.

31. Un método para producir etanol, método que comprende las operaciones de:

(a) poner una composición de biomasa en contacto con una composición enzimática que comprende 029cel según la Reivindicación 15 para producir una disolución de azúcar;

(b) añadir un microorganismo fermentador a la disolución de azúcar; y

(c) cultivar el microorganismo fermentador bajo unas condiciones suficientes para producir etanol.

Figura 1A Secuencia de nucleótidos del DNA ambiental insertado (029cel) ID. SEC. nº 1

Figura 1B

Figura 2 La secuencia de nucleótidos del ORF de 029cel

Figura 3 La proteína 029cel traducida, compuesta de 581 aminoácidos