MOLÉCULAS INHIBIDORAS DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA TIPO 1 (VIH-1), PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y SUS APLICACIONES.

La presente invención se refiere a un aptámero cuya estructura comprende al menos una secuencia de nucleótidos Guanina-Guanina-Citosina-Adenina-Adenina/Guanina-Guanina-Guanina-Adenina,

que es capaz de unirse específicamente a la región 5'UTR del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), proporcionando el procedimiento de obtención de aptámeros con dicha secuencia mediante combinación de técnicas experimentales de selección in vitro de ácidos nucleicos con técnicas computacionales de optimización de secuencia. Asimismo, la invención protege una construcción genética de DNA para sintetizar dichos aptámeros, preferentemente de RNA.

La invención hace también referencia a los diferentes usos del aptámero anterior, incluyendo su uso como molécula biosensora para detectar y/o cuantificar VIH-1, como inhibidor de la producción de partículas virales de VIH-1, así como su aplicación en medicina, protegiendo también un método de tratamiento de una enfermedad causada por VIH-1, y una composición farmacéutica que comprenda dicho aptámero.

Sector de la tïcnica La presente invenciïn se refiere al campo de los aptameros (molïcu las de ïcidos nucleicos obtenidas por selecciïn o evoluciïn in vitro, que poseen la capacidad de unirse especïficamente a una diana molecular detenTIinada) y su uso para el tratamiento de las infecciones producidas por el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-l ) . Por lo tanto, la presente invenciïn se enmarca en el campo de la biotecnologia, y de forma especïfICa en el campo del desarrollo y la elaboraciïn de composiciones farmacïuticas para el tratamiento de enfermedades producïdas por el VIH-l. La presente invenciïn podria tambiïn derivar en un producto de interïs en el campo de la terapia gïnica, asi como en el desarrollo de sistemas de diagnïstico de V1H-l,

Estado de la tïcnica El VIH es el agente causal del sïndrome de inmunodeficiencia humana adquirida (SIDA) , una enfermedad Que afecta al sistema inmunitario de los seres humanos y provoca una inactivaciïn del mismo, De las dos especies diferentes de VIH, la denominada "virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) " es mas virulenta que la "tipo 2" (VIH-2) , y de hecho es la mas extendida en el mundo. La infecciïn por VIH se ha calificado ya como pandemia. Segun datos de la Organizaciïn Mundial de la Salud, en el aïo 2010 alrededor de 34 millones de personas en el mundo eran VIH-positivas, se detectaron alrededor de 2.7 millones de nuevas infecciones y hubo aproximadamente 1, 8 millones de muertes como consecuencia de la infecciïn por VIH (http://www.who.inUhiv/data/2011_epi_core_en, png) , Del total de personas VIH-positivas, sïlo 6, 6 millones estaban recibiendo tratamiento antirretroviral.

El VIH es un retrovirus y se caracteriza, como todos los miembros de la familia Retroviridae, por una alternancia entre fases con genoma de RNA y DNA en su ciclo viral. El RNA genomico del VIH-1 presenta tres regiones codiflCantes principales denominadas gag, poi y env (en orden 5' a 3') flanqueadas por dos regiones no traducibles o UTRs (del inglïs untransla1ed regions) , El gen gag codifica las proteïnas de la nucieocïpside viral y la matriz (denominadas p17, p24 Y p7) ; polccxlifica enzimas para el procesamiento del material genïtico viral y de sus productos gïnicos (transcriptasa reversa o RT, proteasa o PR, e integrasa o IN) ; y env codifica las glicoproteïnas gp120 (superficial) y gp41 (transmembrana ) , responsables de la infecciïn y tropismo viral. El VIH dispone, ademïs, de una serie de genes accesorios (tat, (ev, nef, vpr, vify vpu) tïpicos de lentivirus y Que ejercen papeles reguladores posibilitando, entre otras cosas, la infecciïn de cïlulas no proliferativas, La 5'UTR del RNA viral resulta especialmente relevante por presentar una serie de dominios estructurales altamente conservados entre los diferentes aislados virales. Estos dominios intervienen activamente en procesos clave como la transcripciïn, la transcripciïn reversa, el procesamiento de los RNA mensajeros o el empaquetamiento del RNA genïmico viral en las partïculas infectivas. La 5'UTR puede plegarse en dos conformaciones alternativas, llamadas LDI y BMH (Huthoff and Berkhout, 2001 j, Un hecho de relevancia para la presente invenciïn es que en funciïn del plegamiento adoptado por la 5'UTR, se exponen o no otros dominios estructurales genïmicos Que desempeïan funciones esenciales para el virus, como es el caso de los dominios Poli-A o DIS, Esta transiciïn estructural puede desempeïar un papel en la regulaciïn de procesos virales.

La terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA, en inglïs HAARTj se ha revelado como el tratamiento mïs efectivo de la enfenTIedad: no se consigue su cura pero la reducciïn de la carga viral es evidente en un alto porcentaje de los pacientes infectados, lo Que permite cierta restauraciïn de la funciïn inmunitaria. Ademïs, se ha probado Que la TARGA reduce la propagaciïn del virus desde el individuo enfermo tratado y previene el contagio a los individuos sanos tratados en situaciïn de riesgo. Esta terapia consiste en la combinaciïn de dos o mïs farmacos antirretrovirales, los cuales son compuestos quimicos de diferente naturaleza generalmente encam inados a inhibir las enzimas virales (RT, PR o IN) , o bien a interferir con la fase de adhesiïn entre las proteinas de la cubierta del virus a los receptores de su cïlula diana (principalmente linfocitos T y macrïfagosj, Anualmente se publican las correspondientes recomendaciones de tratamiento, con la indicaciïn de cuales de las combinaciones de fïnTIacos son mas adecuadas en cada caso (http://aidsinfo.nih.govfguidelines) , Compaïïas farmacïuticas de la envergadura de Roche, Merck o GlaxoSmithKline distribuyen actualmente varios de estos medicamentos.

Otro campo de investigaciïn relevante para la presente invenciïn es el de los aptïmeros. Que son molïculas de ïcidos nucleicos obtenidas por selecciïn o evoluciïn in vitro y que poseen la capacidad de unirse especïficamente a una diana molecular detenTIinada. En 1990 se comunicï en dos artïculos independientes la puesta a punto de la tecnologïa de selecciïn in vitro de RNA, en la cual se utilizaba como presiïn selectiva la capacidad del RNA para unirse especïficamente a una molïcula diana. El proceso, basado en ciclos de selecciïn

y amplificaciïn, se denominï "Systematlc Evolutlon of Llgands by EXponentla1 Enrlchment" o SELEX (Tuerk and Gold, 1990) , y se acunï el tïrmino "apta mero" (de la palabra latina aptus, que signifICa encajar) para denominar a las molïculas de RNA generadas por es1e mïtodo (Ellington and Szostak, 1990) .

En la actualidad, el punto de partida de un experimento de selecciïn in vitro de ïcidos nucleioos (RNA o DNA) es una poblaciïn numerosa de molïculas de DNA (tïpicamente, de 10'2 a 10'6) con una regiïn central (por lo general, de entre 20 y 100 nucleïtidos, nt, de longitud) con secuencia aleatoria o altamente mutagenizada. Dicha regiïn central estï flanqueada por dos zonas de uniïn a cebadores especïfioos (de entre 12 y 20 nt de longitud cada una de ellas) cuya secuencia es conocida y permitira las reacciones enzimaticas requeridas en cada ronda:

transcripciïn reversa (RT) que realiza el paso de RNA a DNA, amplificaciïn del DNA por la reacciïn en cadena de la polimerasa (PCR) , y transcripciïn in vitro (IVT) del DNA amplificado a RNA. La selecciïn se introduce en el proceso permitiendo que pasen a la siguiente ronda unicamente las molïculas de acido nucleico capaces de unirse (apta meros) a su diana inmovilizada en un soporte (tïpicamente, columnas de afinidad o nanoparticulas de distinto tipo) , o bien las molïculas capaces de realizar una determinada funciïn bioqu ïmica. En este ultimo caso, las molïculas con capacidad catalïtica obtenidas se denominan Mribozimas" si son de RNA, o bien "desoxirribozimas" o "DNAzimas" si son de DNA. Las molïculas no funcionales se eliminan en cada ronda, mientras que las subpoblaciones funcionales pueden ser analizadas mediante clonaje y secuenciaciïn. Las sLlCesivas rondas de selecciïn y amplificaciïn (generalmente, entre 6 y 15) aumentan la relaciïn entre los acidos nucleioos activos e inactivos presentes en la poblaciïn, hasta que ïsta llega a estar enriquecida en molïculas que poseen el fenotipo (capacidad de uniïn a una diana, o bien actividad bioquïmica) buscado. Todo el proceso se desarrolla in vitro, y las variables experimentales pueden ser oontroladas en detalle. Posteriormente se puso a punto el proceso de "evoluciïn in vitre", que se distingue del de "selecciïn in vitro" porque en el de evoluciïn se introduce oontinuamente una fuente de variabilidad genïtica en la poblaciïn mediante m utaciïn (generalmente, por PCR mutagïnica) y/o reoombinaciïn (Joyce, 2004) . Con ello, la evoluciïn in vitro permite generar nuevas molïculas en cada ronda, mientras que por selecciïn in vitro en cada ronda se trabaja con una subpoblaciïn activa a partir de la existente en la poblaciïn anterior (teniendO como ïnica fuente de variabilidad la tasa de mutaciïn inherente a las enzimas utilizadas) .

Empleando estos sistemas se han obtenido numerosos aptïmeros de RNA y de DNA, cuya afinidad por su diana en ocasiones supera la de los anticuerpos por sus antïgenos. Las dianas reconocidas por los aptïmeros cubren un amplio rango de tamaïo y complejidad molecular, desde iones hasta cïlulas completas, pasando por molïculas pequeïas (como aminoïcidos, nucleïtidos, antibiïticos o meta bolitas) , pïptidos, proteïnas, acidos nucleicos, agregados macromoleculares. virus u orgïnulos celulares. Una ventaja adicional de los aptïmeros es que su producciïn se realiza in vitro (y por tanto no se requiere el uso de animales de experimentaciïn como sï ocurre con los anticuerpos) y que los ïcidos nucleicos resultantes pueden... [Seguir leyendo]

1. Aptïmero caracterizado porque comprende una estructura de secuencia Mon'_Mon2_Mon3_M004_Moo~_Mono_Mon7_Mone,

responsable de la uniïn especifica a zonas accesibles en el plegamiento completo de la regiïn S'-UTR del genoma de virus de la inmunodeficiencia humana VIH tipo 1 (VIH-1 ) , donde Mon' a Mon8 soo monïmeros de ïcido nucleico (nucleïtidos) , siendo Mon1 un nucleïtido de guanina (G) , Mon2 un nucleïtido de guanina (G) , Mon3 un nucleïtido de citosina (C) , Mon4 un nucleïtido de adenina (A) , Mon5 un nucleïtido de adenina (A) o de

guanina (G) , Mon6 un nucleïtido de guanina (G) , Monun nucleïtido de guanina (G) y Mon8 un nucleïtido de adenina (A) , de manera que dicha estructura consiste en un octanucleïtido de secuencia S'-GGGARGGA-3', en donde R es un nucleïtido de adenina (A) o un nucleïtido de guanina (G) ; o el enantiïmero de dicho aptïmero

2. Aptïmero segïn la reivindicaciïn 1 donde la estructura ademïs comprende una regiïn flanqueante previa unida al nucleïtido Mon' y una regiïn flanqueante posterior unida al nucleïtido Mon8 de dicha estructura, donde cada regiïn flanqueante comprende al menos una secuencia de 4 nucleïtidos, donde las bases nitrogenadas de al menos 3 de los 4 nucleïtidos de la regiïn flanqueante previa mïs prïximos a Mon" contiguos o no, se aparean con las bases nitrogenadas de al menos 3 de los 4 primeros nucleïtidos de la regiïn flanqueante posterior mïs prïximos a Mons, de tal manera que la estructura del octanucleïtido Mon1_Mon2_Mon3_Mon4_ Mon5_ Mons _ Mon7_Mon8 con secuencia S'-GGGARGGA--3' forma un lazo terminal monocatenario que cierra un tallo de cadena doble formado por las regiones flanqueantes con dichos nucleïtidos apareados; o el enantiïmero de dicho aptïmero.

3. Aptïmero segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 ï 2, que comprende una estructura de secuencia Mon, w_Mon83 _Mon82-Mon8'-Mon ' _Mon2 _Mon3-Mon 4-Mon5-Moo -Moo 7_M008 _Moob1 _Monb2 _Monb3 _Monb4 donde Mona' a Mona4 y Monb' a Monb4 son nucleïtidos de tal manera que: '

i. las bases nitrogenadas de Mona1 a Mon"" se seleccionan independientemente del siguiente grupoï A, G, G, TyU;

ïj. la base nitrogenada de Monb1 es complementaria a la base nitrogenada de Mona1;

m. la base nitrogenada de Monb2 es complementaria a la base nitrogenada de Mona2; b3 a3

iv. la base nitrogenada de Mones complementaria a la base nitrogenada de Mon;

v. la base nitrogenada de Monb4 es complementaria a la base nitrogenada de Mon"";

donde Mon1 a Mona son los monïmeros definidos en la reivindicaciïfl 1, Y donde las reglas de com~ementariedad a las que estïn sujetos estos apareamientos respectivos de Mona1 a Mon"" con Monb1 a Mon son: A es complementana a T o U; G es complementana a G; G es complementarla a G o U; T es complementaria a A; U es complementaria a A o G; o el enantiïmero de dicho aptïmero.

4. Aptïmero segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que consiste en una molïcula de RNA o de DNA; o el enantiïmero de dicho aptïmero.

5. Aotïmero segïn la reivindicaciïn 3 o segïn las reivindicaciones 3 y 4, donde la estructura Mona4_Mona3_

Mona'2_ Mona'_Mon'_ Mon2_ Mon3_ Mon4_Mon5--Mon6---Mon7_M006_ Monbl_ Monb2 _ Monb3_ Monb4 consiste en un polinucleïtido de secuencia seleccionada entre SEO ID Noï 6 y SEO ID No: 7; o el enantiïmero de dicho aptïmero

6. Aptïmero segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una secuencia nucleotïdica seleccionada del grupo compuesto por: SEO ID No: 10, SEO ID Noï 11 , SEO JO Noï 12, SEO ID No: 13, SEO ID Noï 14, SEO ID No: 15, SEO ID Noï 16, SEO ID No: 17, SEO ID No: 18, SEO ID No: 19, SEO ID No: 20, SEO ID Noï 21, SEO ID No: 22, SEO ID No: 23, SEO ID No: 24, SEO ID No: 25, SEO ID No: 26, SEO ID No: 27, SEO ID Noï 28, SEO ID No: 29, SEO ID No: 3D, SEO ID No: 31, SEO ID No: 32, SEO ID No: 33, SEO ID No: 34, SEO ID No: 35, SEO ID No: 36, SEO ID No: 37 y SEO ID No: 38; o el enantiïmero de dicho aptïmero.

7. Aptïmero segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende una secuencia nucleotïdica seleccionada del grupo compuesto por: SEO ID No: 35 y SEO ID No: 36; o el enantiïmero de dicho aptïmero.

8. Aptïmero segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el nucleïtido del extremo S' presenta una modificaciïn para aumentar la resistencia a la degradaciïn por exonucleasas mediante bloqueo del grupo fosfato del extremo 5'; o el enantiïmero de dicho aptïmero.

9. Aptïmero segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el nucleïtido del extremo 3' presenta una modificaciïn para aumentar la resistencia a la degradaciïn por exonucleasas mediante bloqueo del grupo OH del extremo 3'; o el enantiïmero de d icho aptïmero

10. Construcciïn genïtica de ONA ïtil para la sintesis por transcripciïn, in vitro o intracelular, de un aptïmero

de RNA definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleïtidos de ONA correspondiente a la secuencia de nudeïtidos de dicho aptïmero

11. Procedimiento de obtenciïn de un aptïmero definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque comprende la combinaciïn de tïcnicas experimentales de selecciïn in vftro de ïcidos nudeicos con tïcnicas computacionales de optimizaciïn que permiten analizar tanto las secuencias generadas por selecciïn in vi/ro como sus correspondientes estructuras secundarias , comprendiendoï

a. obtener por transcripciïn in vftro molïculas de RNA de secuencia aleatoria, de al menos 25 nucleïtidos de longitud, flanqueada por regiones anterior y posterior de secuencia constante y conocida;

b. seleccionar y aislar las molïculas de RNA obtenidas en la etapa anterior con mayor afinidad por la molïcula diana correspondiente a la regiïn 5'UTR del VIH-1;

c. obtener y amplificar un cONA obtenido a partir de las molïculas de RNA aisladas en la etapa anterior;

d. secuenciar el cONA amplificado;

e. repetir sucesivos ciclos definidos por las etapas a-d utilizando el producto amplificado en la etapa e como molde para la transcripciïn in vitro de la etapa a, para obtener en la poblaciïn resultante un enriquecimiento progresivo de molïculas con mayor capacidad de uniïn a la diana;

f. clasificar las secuencias de cONA secuenciadas en los distintos ciclos a-d repetidos, comprendiendo cuantificaciïn de la diferencia nudeotïdica existente entre dichas secuencias, alineamiento mïltiple y clïstering o agrupamiento de secuencias de dichos cONA, plegamiento de la secuencia de RNA derivada del cONA a la estructura de mïnima energïa, caracterizaciïn del motivo estructural mïnimo entre secuencias y anïlisis de interacciones entre secuencias de ONA y la diana de RNA 5'UTR del VIH-1 .

12. Uso de un aptïmero o enantiïmero del mismo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, como agente de uniïn especïfica a la regiïn 5'UTR del genoma de VIH-1

13. Uso de un aptïmero o enantiïmero del mismo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, como agente de interferencia de una funciïn ylo actividad de la regiïn 5'UTR del genoma de VIH-1 .

14. Uso de un aptïmero o enantiïmero del mismo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, 30 como inhibidor de la replicaciïn de VIH-1 en un cultivo celular

15. Uso de un aptïmero o enantiïmero del mismo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para detectar, caracterizar ylo cuantificar VIH-1 in vitro

16. Uso de un aptïmero o enantiïmero del mismo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, como biosensor para la detecciïn de VIH-1 en una muestra biolïgica

17. Usode un aptïmero o enantiïmero del mismo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la fabricaciïn de una composiciïn farmacïutica 18. Uso de un aptïmero o enantiïmero del mismo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la fabricaciïn de una composiciïn farmacïutica para el tratamiento ylo prevenciïn de una enfermedad

19. Uso de un aptïmero o enantiïmero del mismo segïn la reivindicaciïn 18, donde la enfermedad es una 40 enfermedad causada por VIH-1

20. Uso de un aptïmero o enantiïmero del mismo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la fabricaciïn de una composiciïn farmacïutica para inhibir la replicaciïn de VIH-1 en un paciente infectado por el mismo.

. Composiciïn farmacïutica caracterizada porque comprende al menos un aptïmero o enantiïmero del

mismo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y al menos un adyuvante farmacïuticamenle aceptable ylo un vehïculo farmacïuticamente aceptable.