Métodos y materiales para la generación reproducible de líneas de células con alta producción de proteínas recombinantes.

Método para la generación de una célula hospedadora productora para la obtención de productos génicos recombinantes que comprende los pasos

(a) proporcionar un vector diana que comprende

(i) un gen informador (RG1) enlazado operativamente a una primera secuencia de control de la expresión que comprende un promotor constitutivo (P1),

(ii) un primer gen marcador de selección (SM1) enlazado operativamente a una segunda secuencia de control de la expresión (P2),

(iii) un segundo gen marcador de selección no funcional (SM2) sin enlace operativo a una secuencia de control de la expresión,

en donde la secuencia (i) está localizada en la posición 5', la secuencia (ii) está localizada entre (i) y (iii) y la secuencia (iii) está localizada en la posición 3'.

(iv) un primer y un segundo sitio de reconocimiento para una enzima mediadora de rotura de la doble cadena, en donde el primer sitio de reconocimiento está localizado entre la primera secuencia de control de la expresión (P1) y el primer gen informador (RG1) y el segundo sitio de reconocimiento está localizado entre la secuencia (ii) y la secuencia (iii),

(b) introducir el vector diana en una célula hospedadora en condiciones tales que permiten la integración aleatoria del vector diana en el genoma de la célula hospedadora,

(c) determinar cuantitativamente el nivel de expresión del gen informador (RG1) y seleccionar una célula hospedadora que tenga integrado de manera estable el vector diana y que exhiba una actividad de transcripción del gen informador (RG1), que es al menos 10 veces mayor comparada con los niveles de expresión medios de la población de clones resultante,

(d) proporcionar un vector de intercambio que comprende:

(i) un gen de interés (GOI), y~

(ii) un segundo gen marcador de selección inactivo (ΔSM2) enlazado operativamente a una tercera secuencia de control de la expresión (P3),

en donde el vector de intercambio comprende una primera secuencia homóloga 5' y una segunda secuencia homóloga 3', que permiten la recombinación con secuencias del vector diana,

(e) introducir el vector de intercambio en una célula hospedadora obtenida en el paso (c) en condiciones que permiten una rotura de la doble cadena en el primer y/o segundo sitio de reconocimiento, como se define en (a) (iv) y una integración del vector de intercambio en el genoma de la célula hospedadora por recombinación homóloga mediada por rotura de la doble cadena,

con lo cual el segundo gen marcador de selección inactivo (ΔSM2) se activa por integración del vector de intercambio por recombinación homóloga con el vector diana,

(f) seleccionar una célula productora que tiene integrado el vector de intercambio por recombinación homóloga con el vector diana integrado, en donde la célula productora expresa el GOI.

Mïtodos y materiales para la generaciïn reproducible de lïneas de cïlulas con alta producciïn de proteïnas recombinantes

1. Campo de la Invenciïn La invenciïn pertenece al campo de la obtenciïn de productos gïnicos recombinantes en cïlulas eucariotas. Particularmente, la invenciïn se refiere a mïtodos y materiales para la generaciïn rïpida y reproducible de lïneas de cïlulas productoras eucariotas de alto rendimiento adecuadas para producciïn en gran escala de productos gïnicos recombinantes.

2. Antecedentes de la Invenciïn La lïnea de cïlulas CHO es una de las cïlulas hospedadoras mïs ampliamente utilizadas para obtenciïn de productos biofarmacïuticos. Clïsicamente, la cïlula hospedadora se transfecta con un constructo de expresiïn que contiene un gen de interïs (GOI) que codifica un producto gïnico recombinante, v.g. una proteïna, y un marcador de selecciïn tal como un antibiïtico, v.g. un gen de resistencia a neomicina o metotrexato. En un pequeïo porcentaje de las cïlulas hospedadoras el constructo de expresiïn se introduce aleatoriamente en el genoma por

recombinaciïn no homïloga. Estas cïlulas transfectadas de manera estable se seleccionan bajo presiïn de selecciïn del compuesto antibiïtico. Para obtener una lïnea de cïlulas derivada de una sola cïlula cumplidora de las reglamentaciones, se realiza subsiguientemente un paso de subclonaciïn por diluciïn limitante. Aunque se analizan varios centenares de clones derivados de cïlulas simples, el nivel de expresiïn era en muchos casos todavïa dïbil, lo que requiere la optimizaciïn de los procedimientos de transfecciïn o la amplificaciïn de copias del constructo de expresiïn integradas inicialmente, v.g., por aumento de la concentraciïn de metotrexato u otro sistema de amplificaciïn. El procedimiento completo requiere al menos 6 meses, a veces hasta un aïo.

El problema principal con este enfoque es la naturaleza aleatoria del evento de integraciïn. El DNA genïmico circundante tiene un efecto de gran importancia sobre la actividad de traducciïn del constructo de expresiïn integrado (quot;efecto de posiciïnquot;) . Debido a la naturaleza estocïstica de este proceso de integraciïn no homïloga, la integraciïn no puede dirigirse a loci con una actividad de transcripciïn alta (puntos calientes de transcripciïn) . Dado que la mayor parte del DNA de mamïfero es no codificante e incluso la parte codificante es sïlo transcripcionalmente activa en pequeïa proporciïn, la mayorïa de los eventos de integraciïn conducirïn a una expresiïn baja del transgïn. En suma, la integraciïn aleatoria de un constructo de expresiïn conducirï a una gran variaciïn en los niveles de expresiïn del transgïn, exhibiendo sïlo una fracciïn de las cïlulas un nivel de expresiïn alto.

Con objeto de soslayar el laborioso proceso de cribado necesario y acortar el tiempo para la generaciïn de una lïnea de cïlulas altamente productora, serïa deseable un sistema para la inserciïn direccionada de cualquier GOI en un punto caliente de expresiïn del genoma de una cïlula hospedadora.

A fin de introducir repetitivamente un GOI en este sitio, el sitio identificado puede suplementarse con secuencias que permitan la inserciïn por recombinasas especïficas de secuencia tales como Cre o FLP. El uso de Flp para tales modificaciones se describe en WO 92/15694 y con modificaciones para el intercambio de casetes de expresiïn de DNA repetitivas exentas de marcadores en US 2001/0032341. El uso de Cre para la modificaciïn del genoma en cïlulas vegetales se describiï en WO 91/09957 y con modificaciones adicionales en US 2006/0014264A1.

Ambas recombinasas son dependientes de sitios de reconocimiento especïficos que tienen que introducirse primeramente en el genoma en una localizaciïn genïmica apropiada. En el caso de animales transgïnicos, esto se consigue por recombinaciïn homïloga.

Con objeto de utilizar estas recombinasas especïficas para la generaciïn de una lïnea de cïlulas de producciïn, el problema principal consiste en identificar un gen adecuado para inserciïn de sitios de reconocimiento por recombinaciïn homïloga. Este gen precisa ser transcrito fuertemente, pero al mismo tiempo no deberïa ser esencial para la cïlula. El locus de inmunoglobulina en una cïlula de mieloma o hibridoma serïa un ejemplo de un locus 45 apropiado de este tipo. La producciïn de anticuerpos por uso de una combinaciïn de recombinaciïn homïloga y recombinaciïn especïfica de secuencia utilizando Cre se describe en WO 96/30498. Un enfoque similar se describe como sistema de expresiïn general de alto rendimiento en EP 11405908A1.

Aunque aplicables, estos mïtodos estïn restringidos a genes celulares conocidos, no esenciales, y fuertemente expresados en la cïlula hospedadora respectiva. Adicionalmente, la recombinaciïn homïloga espontïnea es un 50 evento raro y su eficiencia depende del sitio respectivo. Para alcanzar una eficiencia alta tienen que utilizarse secuencias homïlogas grandes, siendo sumamente eficaces las secuencias isogïnicas. Por tanto, el uso de este enfoque en hospedadores de los que se dispone de informaciïn limitada de secuencia (como el hïmster) limitarï su aplicabilidad.

Con objeto de identificar loci genïmicos aleatoriamente que permitan un alto nivel de expresiïn, se ha descrito la 55 introducciïn en el sitio diana de un vector que contiene un gen informador y los sitios de reconocimiento requeridos para la recombinasa utilizada (WO 2004/029284A3. Si bien el gen informador permite la caracterizaciïn de la capacidad de expresiïn del sitio de integraciïn direccionado aleatoriamente, los sitios de reconocimiento permiten el intercambio del informador contra el GOI.

Puttini et al. (J. Biotechnol. 116 (2005) , 145-151) dan a conocer un mïtodo para transgïnesis direccionada mediada por rotura de la doble cadena en una lïnea de cïlulas. De este modo, se obtienen cïlulas hospedadoras que expresan un gen diana. El vector de direccionamiento comprende un solo sitio de reconocimiento de meganucleasas. Se informa de una eficiencia de direccionamiento baja de 2, 5 x 10-6 (10 clones/2 x 107 cïlulas con 20% de eficiencia de transfecciïn) . Asï pues, este documento no proporciona un mïtodo fiable para obtener cïlulas fuertemente productoras.

WO 2004/029284 describe un mïtodo para la generaciïn de una cïlula hospedadora productora que utiliza una recombinaciïn especïfica del sitio catalizada por recombinasa FLP. Las lïneas de cïlulas de expresiïn resultantes contienen todavïa sitios de reconocimiento de recombinasa FLP, en algunos casos con la secuencia codificante despuïs de introducciïn del gen de interïs. Esto da como resultado una estabilidad reducida de la lïnea de cïlulas productoras. El documento sugiere tambiïn intrones del grupo II como sitios de reconocimiento de recombinaciïn alternativos, pero sin describir evidencia experimental para ello. No se describen endonucleasas buscadoras codificadas por intrones del grupo I de sitios de reconocimiento de meganucleasas.

Sorrel & Kolb (Biotech. ADV 23 (2005) , 431-469) describen una modificaciïn especïfica de sitio de genomas de mamïfero por recombinaciïn homïloga utilizando vectores de direccionamiento que tienen un solo sitio de reconocimiento para la meganucleasa I-Sce-I. La integraciïn de la diana/vector de reemplazamiento ocurre por recombinaciïn homïloga direccionada y no por integraciïn aleatoria.

Belfort & Roberts (Nucleic Acids Res. 25 (1997) , 3379-3388) describen endonucleasas buscadoras que incluyen molïculas codificadas por intrones de grupo I y grupo II.

Con todos estos enfoques, la eficiencia de la reacciïn de intercambio depende de la eficiencia de la recombinasa utilizada. Adicionalmente, el locus seleccionado aleatorio podrïa tener una actividad de transcripciïn satisfactoria, pero podrïa no soportar una recombinaciïn eficiente por la recombinasa utilizada. Con objeto de identificar un locus 25 de integraciïn apropiado, este enfoque requerirï un esfuerzo de cribado adicional. Un obstïculo potencial adicional en el uso de tales recombinasas es la presencia de sitios de pseudo-reconocimiento dentro del genoma de la cïlula hospedadora deseada. Estos sitios de pseudo-reconocimiento podïan conducir a eventos de recombinaciïn indeseables. Esto conducirï a una eficiencia reducida del sistema y a cïlulas genïticas potencialmente modificadas con fenotipo indeseable. Una vez mïs, tiene que realizarse un cribado para identificar las cïlulas mïs adecuadas.

Aunque este enfoque parece funcionar, su eficiencia y aplicabilidad universal en la cïlula productora de alto rendimiento serï baja.

Considerado en su conjunto, existe todavïa necesidad... [Seguir leyendo]

1. Mïtodo para la generaciïn de una cïlula hospedadora productora para la obtenciïn de productos gïnicos recombinantes que comprende los pasos (a) proporcionar un vector diana que comprende (i) un gen informador (RG1) enlazado operativamente a una primera secuencia de control de la expresiïn que comprende un promotor constitutivo (P1) ,

(ii) un primer gen marcador de selecciïn (SM1) enlazado operativamente a una segunda secuencia de control de la expresiïn (P2) ,

(iii) un segundo gen marcador de selecciïn no funcional (SM2) sin enlace operativo a una secuencia de control 10 de la expresiïn,

en donde la secuencia (i) estï localizada en la posiciïn 5', la secuencia (ii) estï localizada entre (i) y (iii) y la secuencia (iii) estï localizada en la posiciïn 3'.

(iv) un primer y un segundo sitio de reconocimiento para una enzima mediadora de rotura de la doble cadena, en donde el primer sitio de reconocimiento estï localizado entre la primera secuencia de control de la expresiïn (P1) y

el primer gen informador (RG1) y el segundo sitio de reconocimiento estï localizado entre la secuencia (ii) y la secuencia (iii) ,

(b) introducir el vector diana en una cïlula hospedadora en condiciones tales que permiten la integraciïn aleatoria del vector diana en el genoma de la cïlula hospedadora,

(c) determinar cuantitativamente el nivel de expresiïn del gen informador (RG1) y seleccionar una cïlula

hospedadora que tenga integrado de manera estable el vector diana y que exhiba una actividad de transcripciïn del gen informador (RG1) , que es al menos 10 veces mayor comparada con los niveles de expresiïn medios de la poblaciïn de clones resultante,

(d) proporcionar un vector de intercambio que comprende:

(i) un gen de interïs (GOI) , y

(ii) un segundo gen marcador de selecciïn inactivo (ΔSM2) enlazado operativamente a una tercera secuencia de control de la expresiïn (P3) ,

en donde el vector de intercambio comprende una primera secuencia homïloga 5' y una segunda secuencia homïloga 3', que permiten la recombinaciïn con secuencias del vector diana,

(e) introducir el vector de intercambio en una cïlula hospedadora obtenida en el paso (c) en condiciones que permiten una rotura de la doble cadena en el primer y/o segundo sitio de reconocimiento, como se define en (a) (iv) y una integraciïn del vector de intercambio en el genoma de la cïlula hospedadora por recombinaciïn homïloga mediada por rotura de la doble cadena,

con lo cual el segundo gen marcador de selecciïn inactivo (ΔSM2) se activa por integraciïn del vector de intercambio por recombinaciïn homïloga con el vector diana,

(f) seleccionar una cïlula productora que tiene integrado el vector de intercambio por recombinaciïn homïloga con el vector diana integrado, en donde la cïlula productora expresa el GOI.

2. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en donde la cïlula hospedadora es una cïlula eucariota, particularmente una cïlula de mamïfero, v.g. una cïlula de roedor tal como una cïlula de ratïn, rata o hïmster, o una cïlula de primate tal como una cïlula humana, preferiblemente una cïlula CHO.

3. El mïtodo de la reivindicaciïn 1 ï 2, en donde el gen informador (RG1) codifica una enzima o un producto gïnico luminiscente o fluorescente.

4. El mïtodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la primera secuencia de control de la expresiïn (P1) comprende como promotor constitutivo el promotor CMV, opcionalmente suplementado con el intrïn A de CMV.

5. El mïtodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la enzima inductora de rotura de la doble cadena es una meganucleasa o una nucleasa buscadora que tiene un sitio de reconocimiento de al menos 10, preferiblemente al menos 12 y mïs preferiblemente 18 nucleïtidos, y se selecciona v.g. de I-SceI, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-CeuI, I-CreI, I-Ppol, I-Tevl, I-Tevll, I-Tevlll, HO y Endo Seel.

6. El mïtodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde se selecciona una cïlula que tiene el vector diana integrado particularmente como una sola copia en un solo sitio del cromosoma de la cïlula hospedadora.

7. El mïtodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el paso de selecciïn (c) estï basado en 5 una detecciïn de la actividad del primer gen marcador de selecciïn (SM1) .

8. El mïtodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el vector de intercambio comprende el gen de interïs (GOI) sin una secuencia funcional de control de la expresiïn, particularmente con una secuencian parcial de control de la expresiïn que es sustancialmente idïntica a la parte 3' de la primera secuencia de control de la expresiïn (P1) en el vector diana.

9. El mïtodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el vector de intercambio comprende el segundo gen marcador de selecciïn incompleto (ΔSM2) enlazado operativamente a una tercera secuencia de control de la expresiïn (P3) , que comprende particularmente un promotor constitutivo, v.g. el promotor SV40.

10. El mïtodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la primera secuencia homïloga 5' tiene una longitud de al menos aproximadamente 500 nucleïtidos y/o la segunda secuencia homïloga 3' tiene una 15 longitud de al menos aproximadamente 500 nucleïtidos.

11. El mïtodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el vector de intercambio comprende adicionalmente un gen marcador de selecciïn negativo, particularmente un gen suicida, v.g., el gen de timidinaquinasa HSV que estï localizado fuera de la secuencia definida por la primera secuencia homïloga 5' y la segunda secuencia homïloga 3'.

12. El mïtodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende adicionalmente (i) introducir un vector que comprende una secuencia de ïcido nucleico que codifica una enzima mediadora de rotura de la doble cadena o un mRNA que codifica una enzima mediadora de rotura de la doble cadena en la cïlula hospedadora antes o durante el paso (e) y que expresa la enzima a fin de permitir la realizaciïn del paso (e) o

(ii) introducir una enzima mediadora de rotura de la doble cadena en la cïlula hospedadora antes o durante el 25 paso (e) y proporcionar la enzima a fin de permitir la realizaciïn del paso (e) .

13. El mïtodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende adicionalmente expresar el gen de interïs (GOI) y obtener el producto gïnico expresado.

14. Un mïtodo para la obtenciïn de productos gïnicos recombinantes, que comprende los pasos

(a) producir una cïlula hospedadora comodïn para la introducciïn de un gen de interïs (GOI) proporcionando un 30 vector diana que comprende

(i) un gen informador (RG1) enlazado operativamente a una primera secuencia de control de la expresiïn que comprende un promotor constitutivo (P1) ,

(ii) un primer gen marcador de selecciïn (SM1) enlazado operativamente a una segunda secuencia de control de la expresiïn (P2) ,

(iii) un segundo gen marcador de selecciïn no funcional (SM2) sin enlace operativo a una secuencia de control de la expresiïn,

en donde la secuencia (i) estï localizada en la posiciïn 5', la secuencia (ii) estï localizada entre (i) y (iii) , y la secuencia (iii) estï localizada en la posiciïn 3',

(iv) un primer y un segundo sitio de reconocimiento para una enzima mediadora de rotura de la doble cadena, particularmente una meganucleasa, en donde el primer sitio de reconocimiento estï localizado entre la primera secuencia de control de la expresiïn (P1) y el primer gen informador (RG1) , y el segundo sitio de reconocimiento 5 estï localizado entre la secuencia (ii) y la secuencia (iii) ,

(b) introducir el vector diana en una cïlula hospedadora en condiciones tales que permiten la integraciïn aleatoria del vector diana en el genoma de la cïlula hospedadora, y

(c) seleccionar una cïlula hospedadora comodïn que tiene integrado de manera estable el vector diana y que exhibe una actividad de transcripciïn del gen informador (RG1) que es al menos 10 veces mayor comparada con los niveles medios de expresiïn de la poblaciïn de clones resultante,

(d) proporcionar un vector de intercambio que comprende:

(i) un gen de interïs, y

(ii) un segundo gen marcador de selecciïn inactivo (ΔSM2) enlazado operativamente a una tercera secuencia de control de la expresiïn (P3) ,

en donde el vector de intercambio comprende una primera secuencia homïloga 5' y una segunda secuencia homïloga 3', que permiten la recombinaciïn con secuencias del vector diana integradas en la cïlula 5 hospedadora,

(e) introducir el vector de intercambio en la cïlula hospedadora proporcionada en el paso (a) en condiciones que permiten una rotura de la doble cadena en el primer y/o el segundo sitio de reconocimiento del vector diana y una integraciïn del vector de intercambio en el genoma de la cïlula hospedadora por recombinaciïn homïloga mediada por rotura de la doble cadena,

con lo cual el segundo gen marcador de selecciïn inactivo (ΔSM2) se activa por una integraciïn del vector de intercambio,

(f) seleccionar una cïlula productora que tiene integrado el vector de intercambio por recombinaciïn homïloga con el vector diana integrado, en donde la cïlula productora expresa el GOI.

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