Métodos y composiciones para la prevención y el tratamiento de la sepsis.

Composición que comprende uno más inhibidores de complemento y uno o más inhibidores del mecanismo de CD14,

en la que:

(i) dicho uno o más inhibidores de complemento comprende un anticuerpo anti-C4a o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-C5a o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-receptor de C5a o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, o un anticuerpo anti-C3a o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo; y (ii) dicho uno o más inhibidores del mecanismo de CD14 comprende nucleótidos antisentido de CD14, un siARN de CD14, un ARNi de CD14, un anticuerpo anti-LPS o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-LBP o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-CD14 o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-TLR4 o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-MD2 o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-TLR2 o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, o un anticuerpo anti-TLR6 o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo; en la que el fragmento funcionalmente equivalente de un anticuerpo se une al mismo componente del sistema de complementos o el mecanismo de CD14 e inhibe la activación del complemento o la función del mecanismo de CD14 sustancialmente de la misma manera que el anticuerpo completo.

Métodos y composiciones para la prevención y el tratamiento de la sepsis Campo de la Invención

[0001] La presente invención se refiere en general a métodos y composiciones para la prevención y el tratamiento de la sepsis y particularmente al uso de una combinación de inhibidores de complemento e inhibidores del mecanismo de CD14 para prevenir o tratar la sepsis.

Descripción de la técnica anterior

Complemento

[0002] El sistema inmune protege al cuerpo frente a bacterias patogénicas, virus, parásitos y otros organismos dañinos. El sistema inmune se divide en dos componentes, el sistema humoral y el sistema celular. En general, el sistema humoral incluye el sistema de complemento y la producción de anticuerpos para defenderse contra patógenos. El sistema de complemento, o simplemente complemento, implica la producción de proteínas que ayudan a los anticuerpos en la defensa del huésped. El complemento es un grupo de por lo menos 30 proteínas unidas a superficie y solubles. La actividad de las proteínas solubles se destruye al calentar el suero a 56°C durante 30 minutos. Las proteínas de complemento están implicadas en la opsonización de microorganismos para fagocitosis, eliminación directa de microorganismos mediante lisis, atracción quimiotáctica de leucocitos a sitios de inflamación, activación de leucocitos y procesado de complejos Inmunes.

[0003] Las proteínas de complemento trabajan en una cascada en la que la unión de una proteína induce la unión de la siguiente proteína en la cascada. La activación de la cascada conduce a la liberación de péptidos pequeños biológicamente activos llamados anafilatoxlnas (C3a, C4a, y la más potente C5a) que contribuyen a la reacción Inflamatoria y finalmente en la formación de un complejo de ataque de membrana (C5b-9 o MAC) que puede Usar la célula diana. Las moléculas de complemento diferentes son sintetizadas por diferentes tipos de células, por ejemplo, los fibroblastos y células epiteliales intestinales producen C1, mientras que la mayoría de los componentes son sintetizados en el hígado.

[0004] Los componentes y el mecanismo del sistema de complemento son conocidos. Básicamente, existen tres mecanismos de complementos, el mecanismo clásico, el mecanismo de lectinas y el mecanismo alternativo. El mecanismo clásico se desencadena principalmente mediante complejos inmunes que contienen antígeno e IgG o IgM, pero también mediante otros agentes como proteína reactiva C. El mecanismo de lectinas se desencadena mediante la unión de la lectinas de unión a mañosa (MBL) o ficolinas a estructuras de carbohidrato (por ejemplo, manano) en superficies exógenas. El mecanismo alternativo se activa principalmente mediante la repetición de polisacáridos y otras estructuras poliméricas, tales como las halladas en bacterias.

[0005] El mecanismo clásico se activa cuando los dominios globulares de C1q (parte del complejo C1qrs) se unen a los fragmentos de Fe de IgM o múltiples moléculas de IgG. En presencia de iones de calcio, esta unión provoca la activación autocatalítica de dos moléculas de C1r. Las moléculas de C1r activan dos moléculas de C1s. La C1s es una serín proteasa que separa C4a de C4b. C4b se une inmediatamente a proteínas adyacentes o carbohidratos en la superficie de la célula diana y, a continuación, se une a C2 en presencia de iones de magnesio. C1s separa C2b de este complejo, produciendo la C3 convertasa del mecanismo clásico, C4b2a. La C3 convertasa separa varios cientos de moléculas de C3 en C3a y C3b. Algunas moléculas de C3b se volverán a unir a C4b2a para producir la C5 convertasa del mecanismo clásico, C4b2a3b. La C5 convertasa separa C5 en C5a y C5b. C5b se une a la superficie de la célula, iniciando la formación de MAC.

[0006] C3a, C4a, y C5a son todas anafilatoxinas. C3a y C5a también son quimioatractores. C3a y C5a tiene la capacidad unirse a mastocitos y basófilos. C5a es también un potente activador de neutrófilos, basófilos y macrófagos y provoca la inducción de moléculas de adhesión en células endoteliales vasculares. C5a también regula por descenso los neutrófilos y los monocitos. Cuando C3a y C5a se unen a sus receptores en los mastocitos y basófilos, estas células liberan histamina y otros péptidos altamente activos en la sangre y los tejidos. Estos péptidos incrementan la permeabilidad de las paredes vasculares permitiendo que los neutrófilos migren en el área. Los neutrófilos son inducidos posteriormente a migrar al sitio de activación del complemento debido al potente efecto quimiotáctico (atrayente) de C5a. Los neutrófilos fagocitan los patógenos invasores y también liberan mediadores que atraen macrófagos al sitio de la infección. Estas células también presentan la capacidad de fagocitar células invasoras y posteriormente inducen la respuesta inflamatoria y eliminan de manera eficaz muchos de los microorganismos de las infecciones.

[0007] El "mecanismo de lectinas" es similar al mecanismo clásico, a excepción de que se inicia mediante la lectina dependiente de calcio MBL que se une a grupos mañosa terminales en la superficie de las bacterias. La MBL es análoga a C1q. Cuando la MBL se une a su diana, se libera y, de este modo, activa tres serín proteasas asociadas conocidas como MASP1, MASP2 y MASP3 (serín proteasa asociada a lectina de unión a mañosa), que son análogas a C1ry C1s. Entre ellas, la MASP2 juega el papel clave en la separación de C4 en C4b y C4a y C2 en C2b y C2a. Después de la activación de C4 y C2, el mecanismo de lectinas es idéntico al mecanismo clásico.

[0008] El mecanismo de complemento alternativo implica un bucle de amplificación utilizando C3b producido por el mecanismo clásico. Algunas moléculas de C3b generadas por la C3 convertasa del mecanismo clásico se canalizaron al mecanismo alternativo. La C3b unida a superficie se une al Factor B para producir C3bB, que se convierte en un sustrato para el Factor D. El factor D es una serín proteasa que separa el fragmento Ba, dejando C3bBb unida a la superficie de la célula diana. C3bBb se estabiliza por properdina (P), formando el complejo C3bBbP, que actúa como la C3 convertasa del mecanismo alternativo. Como en el mecanismo clásico, la C3 convertasa participa en un bucle de amplificación para separar muchas moléculas de C3, dado lugar a la deposición de moléculas C3b en la célula diana. Algunas de estas moléculas de C3b se vuelven a unir a C3bBb para formar C3bBb3b, la C5 convertasa del mecanismo alternativo. La C5 convertasa separa C5 en C5a y C5b. C5b se une a la superficie de la célula para inicia la formación del complejo de ataque de membrana.

[0009] Los mecanismos clásicos, de lectinas y alternativo acaban todos con la formación de C5 convertasa. La C5 convertasa conduce al ensamblaje del MAC a través del mecanismo lítico. Los componentes C5-C8 se unen entre sí en tándem e inducen la inserción de uno o más monómeros de C9 en la bicapa lipídica de la célula diana. Esta inserción conduce a la formación de poros que causan el influjo de calcio con la posterior activación celular de células nucleadas o lisis celular y la muerte si el ataque es suficientemente largo.

El mecanismo de CD14

[0010] CD14 es una glicoproteína unida a glicofosfatidilinositol (GPI) de 53kD y actúa como receptor de endotoxina (LPS) de afinidad elevada en la superficie de monocitos, macrófagos y granulocitos. Dado que CD14 es una proteína unida a GPI no tiene parte transmembrana o intracelular que pueda transmitir señales. CD14 también está presente en forma soluble en suero humano y otros fluidos corporales. CD14 soluble (sCD14) se secreta directamente o deriva de la eliminación dependiente de proteasa de la molécula unida a membrana. sCD14 compite con CD14 unido a membrana (mCD14) por la unión a LPS y es capaz de neutralizar las respuestas inducidas por LPS in vitro e in vivo. SCD14 media en la activación inducida por LPS de células endoteliales, epiteliales y de músculo liso que no expresan CD14. La LBP (proteína de unión a lipopolisacárido) es una glicoproteína de fase aguda de 58 kD y se une a la parte de lípido A de LPS con una afinidad elevada y cataliza la activación celular dependiente de CD14 mediante LPS. MD2 es una proteína de acceso secretada que se une al dominio extracelular del receptor de tipo toll TLR4 y facilita la respuesta a LPS, posiblemente mediante la estabilización de los dímeros de TLR4. El complejo CD14/MD2/TLR4 parece ser el principal, y posiblemente el exclusivo, receptor para LPS aislada de la mayoría de organismos gram negativos.

[0011] Se sabe que el mecanismo de CD14 es importante en la prevención y el tratamiento de la sepsis y se sabe que anticuerpos anti-CD14 son conocidos por atenuar la sepsis a través... [Seguir leyendo]

1. Composición que comprende uno más inhibidores de complemento y uno o más inhibidores del mecanismo de CD14, en la que: (i) dicho uno o más inhibidores de complemento comprende un anticuerpo anti-C4a o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-C5a o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-receptor de C5a o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, o un anticuerpo anti-C3a o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo; y (ii) dicho uno o más inhibidores del mecanismo de CD14 comprende nucleótidos antisentido de CD14, un siARN de CD14, un ARNi de CD14, un anticuerpo anti-LPS o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-LBP o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-CD14 o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-TLR4 o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-MD2 o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-TLR2 o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, o un anticuerpo anti-TLR6 o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo; en la que el fragmento funcionalmente equivalente de un anticuerpo se une al mismo componente del sistema de complementos o el mecanismo de CD14 e inhibe la activación del complemento o la función del mecanismo de CD14 sustancialmente de la misma manera que el anticuerpo completo.

2. Composición, según la reivindicación 1, en la que dicho uno o más inhibidores de complemento comprende un anticuerpo anti-C5a o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo o un anticuerpo anti-receptor de C5a o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo.

3. Composición, según la reivindicación 1, en la que dicho uno o más inhibidores del mecanismo de CD14 comprende nucleótidos antisentido de CD14, un siARN de CD14, un ARNi de CD14, un anticuerpo anti-LPS o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-LBP o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, o un anticuerpo anti-CD14 o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo.

4. Composición, según la reivindicación 3, en la que dicho uno o más inhibidores del mecanismo de CD14 comprende nucleótidos antisentido de CD14, un siARN de CD14, un ARNi de CD14 o un anticuerpo anti- CD14 o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo.

5. Composición, según la reivindicación 1, en la que dicho uno o más inhibidores del mecanismo de CD14 comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo.

6. Composición, según la reivindicación 1, en la que dicho uno o más inhibidores del mecanismo de CD14 comprende un anticuerpo anti-LPS o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti- LBP o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-CD14 o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-TLR4 o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti-MD2 o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, un anticuerpo anti- TLR2 o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo, o un anticuerpo anti-TLR6 o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo.

7. Composición, según la reivindicación 6, en la que dicho uno o más inhibidores del mecanismo de CD14 comprende un anticuerpo anti-LPS o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo.

8. Composición, según la reivindicación 1, en la que la composición comprende: (i) un anticuerpo anti-C5a o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo; y (ii) un anticuerpo anti-LPS o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo.

9. Anticuerpo biespecífico que comprende un primer elemento de unión que se une a C4a, C5a, receptor de C5a, C3a, y un segundo elemento de unión que se une a LPS, LBP, CD14, TLR4, MD2, TLR2 o TLR6.

10. Anticuerpo biespecífico, según la reivindicación 9, que comprende dicho primer elemento de unión que se une a C5a o el receptor de C5a.

11. Anticuerpo biespecífico, según la reivindicación 9, que comprende dicho segundo elemento de unión que se une a CD14.

12. Anticuerpo biespecífico, según la reivindicación 9, que comprende dicho segundo elemento de unión que se une a LPS.

13. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o composición que comprende el anticuerpo biespecífico, según cualquiera de las reivindicaciones a 9 a 12, en la que la composición comprende además uno o más adyuvantes, portadores, excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

14. Kit que comprende un inhibidor de complemento, tal como se indica en la reivindicación 1 ó 2, y un inhibidor del mecanismo de CD14, tal como se indica en cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en el que el inhibidor de complemento y el inhibidor del mecanismo de CD14 se suministran por separado.

15. Kit, según la reivindicación 14, en el que la cantidad de inhibidor de complemento es suficiente para dosis

de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 miligramos por kilogramo de peso corporal por día y la cantidad de inhibidor del mecanismo de CD14 es suficiente para dosis de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 miligramos por kilogramo de peso corporal por día.

16. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el anticuerpo específico, según cualquiera

de las reivindicaciones 9 a 12, para utilizar en el tratamiento o la prevención de la sepsis.

17. Composición, según la reivindicación 16, en la que la composición se administra mediante los modos de administración oral, parenteral, rectal, nasal, tópica, intradérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular,

intratraqueal o intraperitoneal.

18. Inhibidor de complemento, tal como se indica en la reivindicación 1 ó 2, para utilizar en combinación con un inhibidor del mecanismo de CD14, tal como se indica en la reivindicación 1, para el tratamiento o la prevención de la sepsis.

19. Inhibidor del mecanismo de CD14, tal como se indica en cualquiera de las reivindicaciones 3-7, para utilizar en combinación con un inhibidor de complemento, tal como se indica en la reivindicación 1, para el tratamiento o la prevención de la sepsis.