Métodos para predecir la toxicidad cardíaca antes y después del tratamiento con inhibidores de tirosina cinasa.

Un método in vitropara predecir la toxicidad cardíaca en un paciente seleccionado para el tratamiento con un inhibidor de la tirosina cinasa,

comprendiendo dicho método:

- tratar una población de células diana seleccionada de entre adipocitos, células cardíacas o miocardiocitos normales con el inhibidor de tirosina cinasa, y

- determinar si existe un trastorno de la oxidación de ácidos grasos en la población de células diana tratadas, por lo que la presencia de un trastorno de la oxidación de ácidos grasos en la población de células diana tratadas predice que el tratamiento de la población de células diana con el inhibidor de tirosina cinasa es probable que sea tóxico.

Mïtodos para predecir la toxicidad cardïaca antes y despuïs del tratamiento con inhibidores de tirosina cinasa

Antecedentes El corazïn tiene una enorme capacidad para la generaciïn de ATP lo que le permite funcionar como una bomba eficiente durante toda la vida del organismo. El miocardio adulto utiliza ya sea ïcido graso (FA) y/o la oxidaciïn de la glucosa como sus principales fuentes de energïa. En condiciones normales, el corazïn adulto obtiene la mayor parte de su energïa por oxidaciïn de ïcidos grasos en las mitocondrias.

Las cïlulas del miocardio tienen capacidad para ir cambiando entre la glucïlisis de hidratos de carbono y el ciclo de Krebs y a fuentes de combustible de grasa de manera que la producciïn de ATP se mantiene a un ritmo constante en diversas condiciones fisiolïgicas y alimentarias. Esta flexibilidad metabïlica y de selecciïn del combustible es importante para la funciïn cardïaca normal. Aunque la capacidad de conversiïn de energïa cardïaca y el flujo metabïlico estï modulado en muchos niveles, un importante mecanismo de regulaciïn se produce a nivel de la expresiïn gïnica. La expresiïn de los genes que intervienen en mïltiples vïas de transducciïn de energïa estï regulada dinïmicamente en respuesta a las seïales de desarrollo, fisiolïgicas y fisiopatolïgicas.

Los genes que intervienen en estas vïas metabïlicas clave de energïa estïn regulados en la transcripciïn por miembros de la superfamilia de receptores nucleares, especïficamente los receptores activados por proliferador de peroxisoma activado por ïcidos grasos (PPAR) y el coactivador del receptor nuclear, coactivador 1α de PPARγ (PGC-1α) , asï como las proteïnas ERRα, ERRβ y ERRγ relacionadas con el receptor de estrïgenos y sus activadores PGR-1 y PERC. La regulaciïn dinïmica del complejo PPAR/PGC-1 cardïaco de acuerdo con los estados fisiolïgicos y fisiopatolïgicos se describe con mïs detalle a continuaciïn.

PGC-1α es un coactivador de PPARγ, relacionado con la termogïnesis adaptativa en el tejido adiposo pardo. Dos proteïnas relacionadas estructuralmente, PGC-1ï y PARC, se han clonado y parece que intervienen en la regulaciïn de las vïas metabïlicas de la energïa. La naturaleza de la expresiïn de PGC-1α especïfica del tejido e inducible sugiere su implicaciïn en la regulaciïn dinïmica de la energïa celular produciendo procesos metabïlicos, como por ejemplo la biogïnesis mitocondrial y la oxidaciïn, la gluconeogïnesis hepïtica y la absorciïn de la glucosa de los mïsculos esquelïticos. PGC-1α se expresa selectivamente en los tejidos muy oxidativos tales como el corazïn, los mïsculos esquelïticos, tejido adiposo marrïn y el hïgado. En el corazïn la expresiïn de PGC-1α aumenta bruscamente al nacer. Esto coincide con un cambio perinatal desde el metabolismo de la glucosa hasta la oxidaciïn de las grasas. Los niveles de actividad y expresiïn de PGC-1α tambiïn son conocidos por estar inducidos por la exposiciïn al frïo, el ayuno y el ejercicio; estïmulos conocidos por activar el metabolismo oxidativo. La expresiïn forzada de PGC-1 en cardiomiocitos en cultivo induce la expresiïn de genes nucleares y mitocondriales que intervienen en mïltiples vïas de energïa mitocondrial-transducciïn/energïa-producciïn, aumenta el nïmero mitocondrial celular y estimula la respiraciïn acoplada. Las vïas de seïalizaciïn asociadas a estos estïmulos, como por ejemplo la p38 MAP cinasa, ï-adrenïrgico/AMPc, ïxido nïtrico, AMP cinasa, y Ca2-calmodulina cinasa, activan PGC-1α y sus genes diana aguas abajo ya sea por aumento de la expresiïn de PGC-1α o su funciïn de transactivaciïn.

Estos cambios metabïlicos y estructurales puede dar lugar a miocardiopatïa dilatada y disfunciïn diastïlica en el corazïn. Curiosamente, la proliferaciïn mitocondrial es reversible y la miocardiopatïa puede rescatarse tras la reducciïn en la expresiïn transgïnica. Esto sugiere que, ademïs de servir como activador del metabolismo celular de los ïcidos grasos a travïs de las PPAR, PGC-1α estï relacionada con la biogïnesis mitocondrial. Por lo tanto, PGC-1α parece servir como un modulador principal de metabolismo de la energïa oxidativa y responde a los cambios en el estado de la energïa celular.

Estïn apareciendo pruebas de que la familia de receptores relacionados con estrïgenos (ERR) de la funciïn de receptores nucleares huïrfanos como reguladores activados por PGC-1 del metabolismo energïtico del mïsculo cardïaco y esquelïtico. Hay tres miembros de la familia ERR: ERRα, ERRβ y ERRγ. La expresiïn de ERRα y ERRγ

es elevada en los tejidos adultos que se basan principalmente en el metabolismo oxidativo mitocondrial para la producciïn de ATP, como el corazïn y el mïsculo esquelïtico de contracciïn lenta. La expresiïn de ERRα aumenta drïsticamente en el corazïn despuïs del nacimiento, en paralelo con la regulaciïn por incremento mundial de enzimas que intervienen en la absorciïn de ïcidos grasos celulares y la oxidaciïn mitocondrial. Recientemente, ERRα y ERRγ se identificaron como nuevos miembros para la familia PGC-1 de coactivadores. Esta relaciïn funcional entre las isoformas ERR y PGC-1α han estimulado interïs en la funciïn de ERR en el metabolismo energïtico.

La supresiïn del gen ERRα pone de manifiesto una funciïn especïfico de tejido para ERRα en la regulaciïn __/_

constitutiva del metabolismo de los lïpidos. La masa adiposa blanca disminuye en ERRα ratones coincidente con la disminuciïn de tamaïo de los adipocitos y las velocidades de sïntesis de los lïpidos. Por el contrario, ERRα

desempeïa probablemente una funciïn en el catabolismo de los lïpidos en el corazïn, de acuerdo con su interacciïn funcional con PGC-1α. Ratones ERRα __/_, que no presentan un fenotipo cardïaco abierto, presentan un aumento compensatorio en la expresiïn cardiaca de PGC-1α y ERRγ. Estos resultados sugieren que las isoformas de ERR contribuyen a la expresiïn constitutiva de los genes del metabolismo de los ïcidos grasos en el corazïn. Sin embargo, los efectos metabïlicos de los cambios en la expresiïn gïnica sigue siendo desconocidos.

El registro de las caracterïsticas de la expresiïn gïnica en miocitos cardïacos que sobreexpresan ERRα se estï utilizando para identificar genes diana ERRα cardïacos. ERRα activa los genes que intervienen en las vïas de producciïn de energïa, como por ejemplo la absorciïn celular de ïcidos grasos (LPL, CD36/FAT, H-FABP, FACS-1) , ï-oxidaciïn (MCAD, VLCAD, LCHAD) y transporte mitocondrial de electrones/fosforilaciïn oxidativa (citocromo c, COXIV, COXVIII, NADH ubiquinona deshidrogenasa, flavoproteïna-ubiquinona oxidorreductasa, ATP sintasa ï) . ERRα tambiïn aumenta las velocidades de oxidaciïn de palmitato en los cardiomiocitos. La activaciïn de los genes de las enzimas de ï-oxidaciïn por ERRα implica la vïa de seïalizaciïn de PPAR. ERRα activa directamente la expresiïn del gen PPARα, y la regulaciïn mediada por ERRα de MCAD y M-CPT I se suprime en cïlulas procedentes de ratones PPARα__/_. ERRα tambiïn es ahora conocida por estar involucrada en la regulaciïn por PGC-1α de la biogïnesis mitocondrial. Es conocida por mediar la activaciïn de PGC-1α de la vïa de NRF a travïs de la regulaciïn del gen Gapba, que codifica una subunidad del complejo NRF-2 y activa directamente los genes que intervienen en el metabolismo oxidativo mitocondrial en el nivel de la transcripciïn. ERRα con su coactivador PGC1α activa el MCAD, el citocromo c, y los activadores del gen de ATP sintasa ï. En conjunto, estos resultados identifican ERRα como un regulador del metabolismo energïtico oxidativo cardïaco a travïs de su participaciïn en la circuito regulador de PGC-1 . Sin embargo, no se han identificado las funciones biolïgicas precisas de los ERR en el corazïn.

El receptor nuclear ERRγ (receptor gamma relacionado con estrïgenos) se expresa mucho en el corazïn, mïsculos esquelïticos, riïones y cerebro, asï como en el sistema nervioso en desarrollo. La expresiïn de la coactivadores PGC-1α y PGC-1β en cïlulas de mamïfero aumentada potentemente la activaciïn de la transcripciïn por ERRγ. La funciïn de activaciïn 2 constitutiva (AF-2) del receptor huïrfano es importante para el aumento sinïrgico. Anïlisis de truncamiento de receptores funcionales se ha utilizado para identificar una funciïn adicional de activaciïn aminoterminal, especïfico para la isoforma ERRγ2 y PGC-1α.... [Seguir leyendo]

1. Un mïtodo in vitro para predecir la toxicidad cardïaca en un paciente seleccionado para el tratamiento con un inhibidor de la tirosina cinasa, comprendiendo dicho mïtodo:

-tratar una poblaciïn de cïlulas diana seleccionada de entre adipocitos, cïlulas cardïacas o miocardiocitos normales con el inhibidor de tirosina cinasa, y

-determinar si existe un trastorno de la oxidaciïn de ïcidos grasos en la poblaciïn de cïlulas diana tratadas, por lo que la presencia de un trastorno de la oxidaciïn de ïcidos grasos en la poblaciïn de cïlulas diana tratadas predice que el tratamiento de la poblaciïn de cïlulas diana con el inhibidor de tirosina cinasa es probable que sea tïxico.

2. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en donde el inhibidor de la tirosina cinasa es un inhibidor de erbB.

3. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en donde el inhibidor de la tirosina cinasa es Herceptin.

4. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en donde el trastorno de la oxidaciïn de ïcidos grasos se determina midiendo una reducciïn en el contenido de lïpidos de las cïlulas tras el tratamiento con un inhibidor de tirosina cinasa en comparaciïn con la reducciïn en el contenido de lïpidos en las cïlulas que carecen de un trastorno de la oxidaciïn de ïcidos grasos en el tratamiento con un inhibidor de tirosina cinasa.

5. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en donde el trastorno de la oxidaciïn de ïcidos grasos se determina midiendo una cantidad reducida de actividad de al menos una enzima en un ïcido graso vïa metabïlica de oxidaciïn en las cïlulas en comparaciïn con cïlulas que carecen de un trastorno de la oxidaciïn de ïcidos grasos.

6. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en donde el trastorno de la oxidaciïn de ïcidos grasos se determina midiendo una cantidad reducida de ARNm que codifica al menos una enzima en una vïa metabïlica de oxidaciïn de ïcidos grasos en las cïlulas en comparaciïn con cïlulas que carecen de un trastorno de oxidaciïn de ïcidos grasos.

7. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en donde el trastorno de la oxidaciïn de ïcidos grasos se determina midiendo una cantidad de al menos una enzima en una vïa metabïlica de oxidaciïn de ïcidos grasos en las cïlulas tras el tratamiento de cïlulas normales con un inhibidor de tirosina cinasa.

8. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en donde el trastorno de la oxidaciïn de ïcidos grasos se determina midiendo una reducciïn en la cantidad de ATP tras el tratamiento de cïlulas normales con un inhibidor de tirosina cinasa.

9. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en donde la poblaciïn de cïlulas diana son miocardiocitos cultivados y macromolïculas biolïgicas que se seleccionan de entre cinasa activada por AMP fosforilado, una citocina, FNTα, o pNFκB, se determinan en dichos miocardiocitos.

10.El mïtodo de la reivindicaciïn 9, en donde el mïtodo de determinaciïn de macromolïculas biolïgicas en el paciente comprende el anïlisis de un extracto obtenido a partir del tejido del paciente en un analizador de chips.