Métodos para medir la viabilidad celular sin usar células de control.

Un método para medir la fracción de células viables en una población celular mantenida en un medio de cultivo celular,

comprendiendo el método:

(a) detectar una actividad enzimática estable a la muerte celular (Y) en una porción de un medio acondicionado de cultivo celular que no contiene células de la población celular;

(b) destruir la integridad de la membrana de las células en una porción del medio de cultivo celular que contiene células de la población;

(c) detectar una actividad enzimática estable a la muerte celular (X) en las células y medio acondicionado de dicha porción del medio de cultivo celular que contiene células de la población celular; y

(d) comparar el nivel de actividad enzimática estable a la muerte celular (X) en las células y medio acondicionado de la porción del medio de cultivo celular que contiene células con el nivel de actividad enzimática estable a la muerte celular (Y) en la porción del medio acondicionado del cultivo celular que no contiene células;

en el que la fracción de células viables en la población celular se puede calcular según la fórmula:

en la que c 1 .

y f es la fracción del medio acondicionado total presente en la porción del medio acondicionado del cultivo celular que no contiene células de la población celular.

Métodos para medir la viabilidad celular sin usar células de control

Esta Invención se refiere al campo de la biología celular asi como al cultivo celular y manipulación de tejidos mediante ingeniería. Más específicamente, la invención se refiere a métodos para medir la fracción de células viables en una población celular mantenida en un medio de cultivo celular.

El campo de la manipulación de tejidos mediante ingeniería (revisado en Langer y Vacanti, Science, 26:92-926 (1993)) se centra en el uso de matrices o armazones para apoyar el crecimiento y mantenimiento de células. Por ejemplo, la implantación de condrocitos autólogos inducida por matriz (implantes MACI®) es un procedimiento de implantación de condrocitos autólogos (ACI) de segunda generación usado para reparar cartílago. En un implante MACI®, los condrocitos expandidos en cultivo se siembran sobre una matriz de membrana a base de colágeno, la cual facilita más tarde la implantación quirúrgica. Los implantes MACI® se pueden usar para tratar defectos del cartílago artroscópicamente o a través de cirugía mínimamente invasiva.

El uso de matrices en productos manipulados mediante ingeniería de tejidos presenta retos significativos a los investigadores que intentan medir la viabilidad de las células constituyentes de los productos manipulados mediante ingeniería. Los métodos existentes para medir la viabilidad celular se basan en al menos uno de dos rasgos de las células viables: la presencia de una membrana plasmática intacta, y/o su actividad metabólica. In vitro, la muerte celular está acompañada por la pérdida de la integridad de la membrana plasmática. Este fenómeno se puede observar fácilmente en un microscopio usando colorantes vitales. En el ensayo de colorante vital más habitual, el colorante azul de tripán se añade a una suspensión de células. El colorante es excluido de células viables con una membrana intacta, pero tiñe a células muertas o que están muriendo con una membrana destruida. Como alternativa, la viabilidad celular se puede evaluar midiendo uno o más marcadores de la actividad metabólica de las células. Uno de tales enfoques es cuantificar metabolitos clave (por ejemplo, ATP, NADH), que están presentes en células viables pero agotados o ausentes en células muertas. Un enfoque complementario es evaluar las actividades enzimáticas específicas liberadas a partir de células con membrana comprometida. Por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad Cytox-Fluor (Promega, Madison, Wl, n° de Cat. G926) detecta proteasas, tales como tripeptidil peptidasa, liberadas de células muertas usando el sustrato peptídico fluorogénico internamente extinguido bis-(Ala- Ala-Phe)-rodamina-11.

Cuando se aplica a productos manipulados mediante ingeniería genética de tejidos, la mayoría de los ensayos de viabilidad celular existentes requieren que las células se aíslen (recuperen) antes del ensayo. El procedimiento de aislamiento, sin embargo, es a menudo complicado, algunas veces duro, y nunca 1% eficiente. Durante el procedimiento, pueden surgir artefactos de medida a medida que se pierden o mueren células viables, o a medida que se pierden células muertas. Por ejemplo, cuando se evalúan mediante exclusión con azul de tripán, las células recuperadas siempre tienen una viabilidad próxima al 1%, que fracasa al reflejar la viabilidad verdadera de la muestra original a partir de las que se obtuvieron. Los intentos para usar ensayos de viabilidad a base de la actividad metabólica sin recuperar primeramente las células son igualmente un fracaso debido a la interferencia de la matriz, a la unión no específica, al límite superior bajo de detección, al intervalo inadecuado, o a la mala precisión en diferentes tipos de medios. Además, los ensayos de viabilidad celular a base de la actividad metabólica existentes comparten todos ellos una desventaja fundamental, es decir, el requisito de un control positivo y/o negativo, con un número y viabilidad celulares conocidos, a fin de medir la viabilidad de la muestra de ensayo. Para obtener una comparación válida, las células usadas en el control y en las muestras de ensayo tienen que tener el mismo tipo de células procedentes del mismo donante o cepa, y también deben tener el mismo perfil metabólico. Este enfoque no es aplicable a productos de manipulación de tejidos mediante ingeniería, en los que las células, sembradas en matrices tridimensionales, requieren a menudo un perfil metabólico muy diferente de las mismas células que se hacen crecer en suspensión o sobre una superficie bidimensional. Adicionalmente, a menudo no es práctico obtener células extra y preparar controles apropiados en la práctica de la fabricación industrial en la que se evalúa a diario para determinar la viabilidad y el control de calidad un gran número de lotes.

La viabilidad de las células que se transplantan sigue siendo un determinante importante en el tratamiento exitoso con productos manipulados mediante ingeniería de tejidos. Promega Corporation: "Technical Bulletin TB35: "CytoTox-Fluoro Cytotoxicity Assay" Promega Technical Bulletins, no. TB35, junio 26, páginas 1-12, Madison Wl, USA, describe un ensayo que mide el número relativo de células muertas en poblaciones celulares. A la luz de las limitaciones de los ensayos de viabilidad existentes, existe la necesidad de métodos fáciles, rápidos y exactos para medir la viabilidad de células en productos manipulados mediante ingeniería de tejidos. Tales métodos deben operar a lo largo de un amplio intervalo de densidades celulares, y con muchos tipos diferentes de células, medios y matrices. Además, tales métodos de viabilidad celular funcionan ventajosamente sin la necesidad de una población de células de control.

La presente invención proporciona métodos para medir fácil, rápida y exactamente la viabilidad de células en una variedad de condiciones y sin la necesidad de células de control. Los métodos se basan, en parte, en el descubrimiento de que la viabilidad de células en un producto de ingeniería tisular cultivado se puede determinar detectando la fracción de una o más actividades enzimáticas de las células cultivadas que están presentes en el sobrenadante del cultivo.

Se teoriza, pero sin depender de ello para los fines de la Invención, que con la pérdida de la integridad de la membrana que acompaña a la muerte celular, los contenidos de la célula normalmente unidos por la membrana plasmática se hacen detectables en el sobrenadante del cultivo celular. Los métodos de la invención se basan en la detección de una proteína o enzima estable a la muerte celular, es decir, una proteína o enzima que se puede detectar tanto si está presente en células vivas o muertas. La viabilidad celular del cultivo se puede determinar entonces detectando la cantidad relativa de la proteína o enzima estable a la muerte celular en el medio acondicionado que no contiene células (por ejemplo sobrenadante, o matriz o armazón de soporte) y el medio acondicionado que contiene células (por ejemplo, las células de membrana intacta y el medio acondicionado asociado). La cantidad de proteína o enzima estable a la muerte celular en solamente las células del medio acondicionado que contiene células se puede determinar interrumpiendo la Integridad de la membrana de células con membrana intacta, por ejemplo mediante lisis parcial o completa, midiendo la actividad enzimática total en la porción que contiene las células (es decir, células destruidas y medio acondicionado asociado), y restando entonces cualquier actividad enzimática contribuida por el medio acondicionado asociado. El valor que se resta se mide ensayando el medio acondicionado libre de células.

Un aspecto de la Invención proporciona métodos para medir la fracción de células viables en una población celular mantenida en un medio de cultivo detectando la actividad de una proteína o enzima estable a la muerte celular en una porción del medio acondicionado que no contiene células (por ejemplo, medio acondicionado), detectando una actividad de una proteína o enzima estable a la muerte celular en una porción del medio que contiene células (por ejemplo, células y medio acondicionado), y comparando el nivel de actividad de una proteína o enzima estable a la muerte celular en las dos porciones. Mediante este método, la fracción de células viables en la población es proporcional a la diferencia entre el nivel de actividad de una proteína o enzima estable a la muerte celular en la porción que contiene células y aquel de la porción que no contiene células.

En algunas realizaciones, las células evaluadas se pueden hacer crecer en un sustrato de cultivo celular bidimensional tradicional, por ejemplo vidrio o plástico de cultivo tisular. En otras... [Seguir leyendo]

1. Un método para medir la fracción de células viables en una población celular mantenida en un medio de cultivo celular, comprendiendo el método:

(a) detectar una actividad enzimática estable a la muerte celular (Y) en una porción de un medio acondicionado de cultivo celular que no contiene células de la población celular;

(b) destruir la integridad de la membrana de las células en una porción del medio de cultivo celular que contiene células de la población;

(c) detectar una actividad enzimática estable a la muerte celular (X) en las células y medio acondicionado de dicha porción del medio de cultivo celular que contiene células de la población celular; y

(d) comparar el nivel de actividad enzimática estable a la muerte celular (X) en las células y medio acondicionado de la porción del medio de cultivo celular que contiene células con el nivel de actividad enzimática estable a la muerte celular (Y) en la porción del medio acondicionado del cultivo celular que no contiene células;

en el que la fracción de células viables en la población celular se puede calcular según la fórmula:

X-cY X + Y

1-f

en la que c=. y f es la fracción del medio acondicionado total presente en la porción del medio acondicionado del cultivo celular que no contiene células de la población celular.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el método es un método para medir la fracción de células viables en un producto de ingeniería tlsular mantenido en un medio de cultivo celular, y en el que el método comprende:

(a) detectar una actividad enzimática estable a la muerte celular (Y) en una porción de un medio acondicionado de cultivo celular que no contiene células del producto de ingeniería tisular;

(b) destruir la integridad de la membrana de las células en una porción del medio de cultivo celular que contiene células del producto de ingeniería tisular;

(c) detectar una actividad enzimática estable a la muerte celular (X) en las células y medio acondicionado de dicha porción del medio de cultivo celular que contiene células del producto de ingeniería tisular; y

(d) comparar el nivel de actividad enzimática estable a la muerte celular (X) en la porción del medio de cultivo celular que contiene células y medio acondicionado del producto de ingeniería tisular con el nivel de actividad enzimática estable a la muerte celular (Y) en la porción del medio acondicionado de cultivo celular que no contiene células del producto de ingeniería tisular,

en el que la fracción de células viables en el producto de ingeniería tisular se puede calcular según la fórmula:

X-cY X + Y

en la que c =

1-f

y f es la fracción del medio acondicionado total presente en la porción del medio acondicionado

de cultivo celular que no contiene células de la población celular.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el método es un método para medir la fracción de células viables en un producto de ingeniería tisular mantenido en un medio de cultivo celular, y en el que el método comprende:

(a) proporcionar una porción de muestra del producto de ingeniería tisular que contiene células y una cantidad proporcional de un medio acondicionado de cultivo celular;

(b) detectar una actividad enzimática estable a la muerte celular (Y) en una porción de un medio acondicionado de cultivo celular que no contiene células del producto de ingeniería tisular procedente de la porción de muestra proporcionada en la etapa (a);

(c) destruir la Integridad de la membrana de las células en la porción de muestra del producto de ingeniería tisular proporcionada en la etapa (a);

(d) detectar una actividad enzimática estable a la muerte celular (X) en las células y medio acondicionado de

la porción de muestra del producto de ingeniería tisular proporcionada en la etapa (a); y

(e) comparar el nivel de actividad enzimática estable a la muerte celular detectada en las etapas (b) y (d), en el que, cuando la relación del porcentaje de células totales al porcentaje de medio acondicionado de cultivo celular total en la porción de muestra es 1:1, la fracción de células viables en el producto de ingeniería tisular se puede calcular según la fórmula:

X-cY X + Y

1-f

en la que c=. y f es la fracción del medio acondicionado de muestra total presente en la porción del medio

acondicionado de cultivo celular que no contiene células de la población celular;

y en el que cuando la relación del porcentaje de células al porcentaje de medio acondicionado de cultivo celular en la porción de muestra se desvía de 1:1, la fracción de células viables en el producto de Ingeniería tisular se puede calcular según la fórmula:

X-cY

X + Y + 2Y(cc-1)

1-f

en la que c=. y f es la fracción del medio acondicionado de muestra total presente en la porción del medio

acondicionado de cultivo celular que no contiene células de la población celular;

y en el que a es la relación del porcentaje de células totales al porcentaje del medio acondicionado total presente en la muestra.

4. El método de la reivindicación 3, en el que la integridad de la membrana de las células en la porción de muestra del producto de ingeniería tisular se destruye mediante cizallamiento, ultrasonidos, baja presión barométrica, temperatura elevada, baja temperatura, llsis química o enzimática, o agentes de desacoplamlento de la membrana.

5. El método de la reivindicación 4, en el que la integridad de la membrana de las células en la porción de muestra del producto de ingeniería tisular se destruye mediante adición de un anfífilo.

6. El método de la reivindicación 5, en el que el anfífilo es saponlna.

7. El método de la reivindicación 1, en el que el método es un método para medir la fracción de células viables en un producto de Ingeniería tisular mantenido en un medio de cultivo celular, y en el que el método comprende:

(a) proporcionar una porción del producto de ingeniería tisular que contiene células y una cantidad proporcional del medio acondicionado de cultivo celular;

(b) proporcionar una porción del medio acondicionado de cultivo celular, proporcionada en la etapa a), que no contiene células del producto de ingeniería tisular;

(c) añadir saponina y bis-(Ala-Ala-Phe)-rodamina-11 a las muestras proporcionadas en las etapas a) y b); y

(d) detectar las fluorescencias correspondientes a bis-(Ala-Ala-Phe)-rodamlna-11 escindido en las muestras proporcionadas en las etapas a) y b), en el que las células son condrocltos humanos, mantenidos en una matriz a una densidad de entre 1,5 x 14 y 6 x 1® células/cm2

8. Un método para medir la citotoxicidad de un tratamiento para células en un producto de Ingeniería tisular mantenido en un medio de cultivo celular, que comprende:

(a) aplicar el tratamiento al producto de ingeniería tisular;

(b) detectar una actividad enzimática estable a la muerte celular (Y) en una porción de un medio acondicionado de cultivo celular que no contiene células del producto de ingeniería tisular;

(c) destruir la integridad de la membrana de las células en una porción del medio de cultivo celular que contiene células del producto de ingeniería tisular;

(d) detectar una actividad enzimática estable a la muerte celular (X) en las células y medio acondicionado de dicha porción del medio de cultivo celular que contiene células del producto de ingeniería tisular; y

(e) comparar el nivel de actividad enzimática estable a la muerte celular (X) en la porción del medio de cultivo celular que contiene células del producto de ingeniería tisular con el nivel de actividad enzimática estable a la

muerte celular (Y) en la porción del medio acondicionado de cultivo celular que no contiene células del producto de Ingeniería tlsular,

en el que la citotoxlcidad del tratamiento es proporcional a la diferencia en la fracción de células viables en el producto de ingeniería tisular tratado a un producto de Ingeniería tlsular no tratado, y en el que la fracción de células viables en el producto de ingeniería tlsular se puede calcular según la fórmula:

X-cY X + Y

1 ~f

en la que c=. y f es la fracción del medio acondicionado total presente en la porción del medio acondicionado de cultivo celular que no contiene células de la población celular.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 u 8, en el que las células son de mamífero.

1. El método de la reivindicación 9, en el que las células son humanas.

11. El método de la reivindicación 1, en el que las células son condrocltos.

12. El método de la reivindicación 9, en el que las células se hacen crecer sobre una matriz.

13. El método de la reivindicación 9, en el que las células están presentes a una densidad entre 1,5 x 14 y 6 x 16 células/cm2

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1,2, 3, 7 u 8, en el que las células están presentes a una densidad elevada de al menos 2, x 15 células/cm2

15. El método de la reivindicación 14, en el que las células están presentes entre 2 x 15 y 6 x 16 células/cm2

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 7 u 8, en el que la actividad enzimática estable a la muerte celular se mide mediante las etapas que comprenden:

(a) poner en contacto una muestra con un sustrato de la actividad enzimática estable a la muerte celular, en el que el sustrato está conjugado a un grupo saliente detectable; y

(b) detectar el grupo saliente,

en el que la cantidad de grupo saliente detectada es proporcional al nivel de actividad enzimática estable a la muerte celular.

17. El método de la reivindicación 16, en el que el grupo saliente es cromogénico, luminogénico, o fluorescente.

18. El método de la reivindicación 17, en el que el grupo saliente es fluorescente.

19. El método de la reivindicación 18, en el que el grupo saliente es rodamina-11.

2. El método de la reivindicación 16, en el que el sustrato es bis-(Ala-Ala-Phe)-rodamina-11.

21. El método de la reivindicación 18, en el que el grupo saliente es un derivado de cumarina.

22. El método de la reivindicación 21, en el que el grupo saliente es AMC.

23. El método de la reivindicación 22, en el que el sustrato es Ala-Ala-Phe-AMC.

24. El método de la reivindicación 16, que comprende además la etapa de añadir un agente que modula la señal del grupo saliente detectable.

25. El método de la reivindicación 24, en el que el agente que modula la señal del grupo saliente atenúa la señal del grupo saliente.

26. El método de la reivindicación 25, en el que el agente que atenúa la señal del grupo saliente es rojo de fenol.

27. El método de la reivindicación 26, en el que el rojo de fenol está presente a una concentración de hasta 5 mg/l.

28. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 7 u 8, en el que la actividad enzimática estable a la muerte celular es proteolítica.

29. El método de la reivindicación 28, en el que la actividad enzimática estable a la muerte celular comprende una o

más tripeptidil peptidasas.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 7 u 8, en el que la actividad enzlmátlca estable a la muerte celular es actividad enzimátlca estable tanto a la muerte celular de forma necrótica como a la muerte celular programada.

31. El método de la reivindicación 3, en el que la actividad enzimática estable a la muerte celular es una actividad

enzimática estable a la muerte celular programada.

32. El método de la reivindicación 3, en el que la actividad enzimática estable a la muerte celular es una actividad enzimática estable de forma necrótica.