Métodos para la detección mejorada de moléculas pequeñas de RNA.

Un método para transcripción inversa de una secuencia diana de RNA pequeña de longitud inferior a aproximadamente 100 nucleótidos,

que comprende:

(a) poner en contacto una muestra que comprende la secuencia diana de RNA pequeña con:

(i) un cebador que es suficientemente complementario a la secuencia diana de RNA pequeña para hibridarse a ella, y

(ii) una DNA-polimerasa dependiente de RNA que tiene actividad de transcriptasa inversa; y

(b) sintetizar cDNA complementario a la secuencia diana de RNA pequeña en presencia de una mezcla de dNTPs que comprende al menos un dNTP modificado en la base y estabilizador de dúplex que es un sustrato para la DNA10 polimerasa dependiente de RNA.

Métodos para la detección mejorada de moléculas pequeñas de RNA Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a métodos mejorados para la mejora de moléculas de RNA. Más particularmente, la invención se refiere al uso de nucleósido-trifosfatos modificados en la base y estabilizadores de dúplex en reacciones de transcripción inversa para la mejora de la estabilidad de dúplex durante la detección subsiguiente basada en amplificación de secuencias cortas de RNA, tales como miRNA.

Los micro-RNAs (miRNAs) son una clase muy conservada de moléculas pequeñas de RNA que se transcriben a partir de DNA pero no se traducen en proteína. Los miRNAs se procesan en moléculas monocatenarias de ~ 17-24 nucleótidos (nt) que se incorporan en el complejo de silenciación inducido por RNA (RISC) y han sido identificados como reguladores clave del desarrollo y la proliferación, apoptosis y diferenciación celular. RISC media la regulación decreciente de la expresión génica por inhibición de la traducción, escisión de transcritos, o ambas cosas. RISC está implicado también en la silenciación de la transcripción en el núcleo de una amplia gama de eucariotas.

Los miRNAs y otras moléculas pequeñas de RNA han sido implicados en cierto número de enfermedades humanas tales como cáncer, enfermedad cardiovascular, infección viral y trastornos metabólicos. De acuerdo con ello, es crucial disponer de métodos analíticos específicos y sensibles para detección de cuándo, dónde y a qué niveles se expresan los RNAs pequeños (sea regulados en sentido creciente o decreciente), a fin de conseguir el potencial de diagnóstico y terapéutico plenos de esta nueva clase importante de dianas. Lamentablemente, debido a su pequeño tamaño, la aplicación de metodologías convencionales de detección de ácidos nucleicos, tales como las técnicas basadas en amplificación, a la detección de RNAs pequeños ha sido problemática. Su pequeño tamaño ofrece poca secuencia para diseño de sondas de hibridación y, de hecho, la mayoría de los cebadores convencionales de PCR son similares en longitud a los miRNAs propiamente dichos.

Se han utilizado diversos métodos para la detección de miRNAs que incluyen transferencias Northern, extensión de cebadores, ribozimas de amplificación de señal y algunas técnicas basadas en amplificación. Sin embargo, estas y otras estrategias convencionales para detección de RNAs pequeños han estado asociadas con problemas relacionados con especificidad, sensibilidad, coste y/o facilidad de implementación.

Por tanto, existe en la técnica necesidad de composiciones versátiles, simples y económicas, métodos y kits para uso en la detección de secuencias pequeñas de RNA, que permitan amplificación y detección rápida y robusta. La presente invención aborda estas necesidades y ofrece otras ventajas relacionadas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra cebadores ilustrativos directos e inversos diseñados para la detección de miR-155 por reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR).

La Figura 2 muestra la eficiencia y sensibilidad de detección mejoradas conseguidas por incorporación de dNTPs modificados en la base y estabilizadores de dúplex en una cadena de cDNA antes de la amplificación por PCR.

Sumario de la invención

Como se ha indicado arriba, la presente descripción se refiere en general al uso de nucleósido-trifosfatos modificados en la base y estabilizadores de dúplex en reacciones de transcripción inversa para la mejora de la estabilidad de dúplex durante la detección subsiguiente basada en amplificación de secuencias cortas de RNA, tales como miRNA.

Para ello, se proporciona un método para transcripción inversa de al menos una secuencia diana de RNA, tal como una secuencia diana de RNA pequeña, que comprende: (a) poner en contacto una muestra que comprende una secuencia diana de RNA con: (i) un cebador que es suficientemente complementario a la secuencia diana de RNA para hibridarse a ella, y (ii) una DNA-polimerasa dependiente de RNA que tiene actividad de transcriptasa inversa; y (b) sintetizar cDNA complementario a la secuencia diana de RNA en presencia de una mezcla de dNTPs que comprende al menos un dNTP modificado en la base y estabilizador de dúplex que es un sustrato para la DNA- polimerasa dependiente de RNA.

Esencialmente, cualquier dNTP modificado en la base y estabilizador de dúplex puede utilizarse conforme a la presente invención, con tal que el mismo sea un sustrato para la DNA-polimerasa dependiente de RNA y con la condición adicional de que el mismo dé como resultado propiedades de hibridación mejoradas, como se describen en esta memoria, cuando se incorpora en cDNA.

En algunas realizaciones de la invención, por ejemplo, el dNTP modificado en la base y estabilizador de dúplex es una pirimidina sustituida en la posición 5, y que es un sustrato para una enzima transcriptasa inversa.

En algunas realizaciones, el dNTP modificado en la base y estabilizador de dúplex comprende un compuesto que tiene la estructura siguiente:

X se selecciona de -F, -Cl, -Br, -I, -CH3 o

------- CH-iR.

Y se selecciona de -F, -Cl, -Br, -I o

ch2r.

y

Res -H, -OH, -OCH3 o -NH2.

En algunas realizaciones, el dNTP modificado en la base y estabilizador de dúplex se selecciona de d(2-amA)TP, d(5-Prll)TP, d(5-PrC)TP, o una combinación de los mismos.

La invención se emplea en la detección de secuencias diana de RNA pequeñas en donde la detección por métodos basados en amplificación por técnicas convencionales ha resultado problemática. En ciertas realizaciones, la diana de RNA es una diana de RNA pequeña, tal como una secuencia de RNA de aproximadamente 1-3 nucleótidos de longitud. En ciertas otras realizaciones, la secuencia diana de RNA pequeña es miRNA.

Además de la incorporación de dNTPs modificados en la base y estabilizadores de dúplex en cDNA durante la transcripción inversa, se entenderá que los dNTPs modificados en la base y estabilizadores de dúplex pueden incorporarse también en los cebadores u otros oligonucleótidos utilizados durante la transcripción inversa y/o durante la amplificación subsiguiente para mejorar ulteriormente sus propiedades de hibridación, y pueden incorporarse adicionalmente en los productos de amplificación sintetizados durante la amplificación, si es necesario o si se desea.

En algunas realizaciones de la invención, el cebador utilizado en la síntesis de cDNA se utiliza también como cebador inverso en una realización de amplificación subsiguiente, mientras que, en otra realización, se utiliza un cebador inverso diferente.

En algunas realizaciones, el método arriba descrito comprende además los pasos de: (a) tratar el cDNA formado en el paso (b) para proporcionar cDNA monocatenario; y (b) poner en contacto el cDNA monocatenario con un segundo cebador que es suficientemente complementario al cDNA para hibridarse al mismo e iniciar la síntesis de un producto de extensión en presencia de una DNA-polimerasa a fin de producir una molécula de cDNA bicatenario.

En algunas realizaciones, la invención comprende además el paso de realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico utilizando cebadores de amplificación que son suficientemente complementarios a la secuencia diana de DNA pequeña y su complemento para hibridarse a ella y dar lugar a productos de amplificación en presencia de DNA-polimerasa. En algunas realizaciones, la reacción de amplificación de ácido nucleico es una reacción en cadena de polimerasa. Como se ha indicado arriba, la reacción de amplificación puede realizarse opcionalmente en presencia de una mezcla de dNTPs que contienen al menos un dNTP modificado en la base y estabilizador de dúplex, de tal modo que los dNTPs modificados se incorporan en los productos de amplificación.

Conforme a otro aspecto de la descripción, se proporcionan mezclas de reacción utilizadas en la realización de los métodos de la presente invención. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una mezcla de reacción de la invención comprende (a) una muestra que comprende una secuencia diana de RNA, tal como al menos una secuencia diana de RNA pequeña; (b) un cebador que es suficientemente complementario a la secuencia diana de RNA para hibridarse con ella, (c) una DNA-polimerasa dependiente de RNA que tiene actividad de transcriptasa inversa; y (d)

una mezcla de dNTPs que contiene al menos un dNTP modificado en la base y estabilizador de dúplex, como se describe en esta memoria, que es un sustrato para la DNA-polimerasa dependiente de RNA.

Conforme a otro aspecto, la descripción proporciona kits que comprenden... [Seguir leyendo]

1. Un método para transcripción inversa de una secuencia diana de RNA pequeña de longitud inferior a aproximadamente 1 nucleótidos, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra que comprende la secuencia diana de RNA pequeña con:

(i) un cebador que es suficientemente complementario a la secuencia diana de RNA pequeña para hibridarse a ella,

y

(ii) una DNA-polimerasa dependiente de RNA que tiene actividad de transcriptasa inversa; y

(b) sintetizar cDNA complementario a la secuencia diana de RNA pequeña en presencia de una mezcla de dNTPs que comprende al menos un dNTP modificado en la base y estabilizador de dúplex que es un sustrato para la DNA- 1 polimerasa dependiente de RNA.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además el paso de realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico que utiliza cebadores de amplificación que son suficientemente complementarios a la secuencia diana de RNA pequeña y su complemento para hibridarse a ella y dar lugar a productos de amplificación en presencia de DNA-polimerasa.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la mezcla de dNTPs comprende

(a) un dNTP modificado en la base y estabilizador de dúplex que es una pirimidina sustituida en la posición 5;

(b) un dNTP modificado en la base y estabilizador de dúplex que tiene la fórmula:

X se selecciona de -F, -Cl, -Br, -I, -CH3 o

ch2r.

Y se selecciona de -F, -Cl, -Br, -I o

-------- nHoR

R es -H, -OH, -OCH3 o -NH2; y/o

(c) un dNTP modificado en la base y estabilizador de dúplex seleccionado de d(2-amA)TP, d(5-PrU)TP y/o d(5- PrC)TP.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la mezcla de dNTPs comprende al menos dos de d(2-amA)TP, d(5- PrU)TP y d(5-PrC)TP y/o dGTP.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la secuencia diana de RNA pequeña tiene aproximadamente 1 a 3

nucleótldos de longitud.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la secuencia diana de RNA pequeña es una secuencia de mIRNA.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el cebador tiene incorporado en él uno o más dNTPs modificados en la base y estabilizadores de dúplex.

8. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente los pasos de:

(a) tratar el cDNA formado en el paso (b) para proporcionar cDNA monocatenarlo;

(b) poner en contacto el cDNA monocatenario con un segundo cebador que es suficientemente complementario al cDNA para hibridarse al mismo e iniciar la síntesis de un producto de extensión en presencia de una DNA- pollmerasa para producir una molécula de cDNA blcatenario.

9. El método de la reivindicación 2, en donde la reacción de amplificación de ácido nucleico es una reacción en

cadena de pollmerasa.

1. El método de la reivindicación 2, en donde uno o más de los cebadores de amplificación comprende dNTPs modificados en la base y estabilizadores de dúplex incorporados en él.

11. El método de la reivindicación 2, en donde la reacción de amplificación se realiza en presencia de una mezcla de 2 desoxinucleósido-5'-trifosfatos que contiene al menos un dNTP modificado en la base y estabilizador de dúplex.