Métodos para la amplificación, cuantificación e identificación de ácidos nucleicos.

Un método para amplificar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas a partir de una combinación de moléculas de ácido nucleico,

que comprende:

(a) amplificar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas en una reacción combinada de primera ronda que incluye una pluralidad de pares de cebadores externos, siendo cada par específico para una secuencia de ácido nucleico seleccionada, en donde la reacción de amplificación combinada amplifica más de aproximadamente 4 moléculas de ácido nucleico seleccionadas y en donde la reacción combinada de primera ronda se deja proceder durante hasta aproximadamente 15 ciclos;

(b) diluir los amplicones y los componentes restantes de reacción de dicha reacción combinada de primera ronda en una pluralidad de reacciones de amplificación de segunda ronda incluyendo cada una al menos un par de cebadores internos, siendo cada par específico para una de dichas secuencias de ácido nucleico seleccionadas, en donde dicha dilución es tal que la cantidad de cebadores externos introducida en cada una de dichas reacciones de amplificación de segunda ronda es insuficiente para alterar la amplificación de dichas moléculas de ácido nucleico seleccionadas usando dichos cebadores internos y en donde la dilución es una dilución de al menos un factor 25; y

(c) amplificar adicionalmente dichas moléculas de ácido nucleico seleccionadas en dicha pluralidad de reacciones de amplificación de segunda ronda, mediante lo cual cada reacción de segunda ronda amplifica adicionalmente un subconjunto de dicha pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas respectivamente a partir de dichos cebadores internos

Métodos para la amplificación, cuantificación e identificación de ácidos nucleicos Campo técnico La presente invención se refiere a métodos de amplificación, identificación y cuantificación de ácidos nucleicos y en particular a métodos mejorados para amplificar y cuantificar o identificar una pluralidad de genes o productos de expresión génica para uso en diagnóstico, uso forense y uso en investigación. La invención también se refiere a la amplificación, identificación y cuantificación más precisa de múltiples secuencias de ácido nucleico a partir de muestras pequeñas y degradadas de ácidos nucleicos.

En particular, la invención se refiere a la amplificación y cuantificación simultánea de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico y se describirán a partir de ahora en este documento con referencia a esta aplicación. Sin embargo, se apreciará que la invención no se limita a este campo de uso particular.

Antecedentes Cualquier análisis de la técnica previa durante toda la memoria descriptiva no debe considerarse de ningún modo como una admisión de que dicha técnica previa es ampliamente conocida o forma parte del conocimiento general común en el campo. Los métodos conocidos para analizar la expresión génica incluyen el uso de PCR o PCR anidada para amplificar una secuencia de ADNc seleccionada, que representa el producto de expresión de un único gen de una combinación de moléculas de ADNc que representan muchos genes diferentes. En una reacción de PCR de un único gen los productos de expresión génica de un único gen normalmente se amplifican usando un par de cebadores en una única ronda de PCR. En una reacción de amplificación por PCR anidada típica se amplifica una única secuencia muy rara mediante dos reacciones de PCR secuenciales, consistiendo cada una en 30-40 ciclos usando una única combinación de cebador anidado. La PCR anidada se usa normalmente para obtener un clon de una secuencia rara y no se considera normalmente para la cuantificación de expresión génica o identificación de un gen. Para identificar el nivel de expresión génica usando PCR, normalmente se estima la cantidad de cada producto de PCR de interés usando PCR a tiempo real cuantitativa convencional (qPCR) para medir la acumulación de productos de PCR a tiempo real después de cada ciclo de amplificación. Esto utiliza normalmente un indicador detectable tal como un colorante intercalante, un colorante de unión al surco menor o sonda fluorogénica mediante la cual la aplicación de luz excita el indicador para que emita fluorescencia y la fluorescencia resultante se detecta normalmente usando una cámara CCD o sistema de detección fotomultiplicador, tal como el descrito en el documento US 6.713.297. Aunque ahora son rutinarios los métodos de análisis de un único gen, surgen dificultades cuando deben amplificarse múltiples productos de expresión génica dentro de la misma reacción de PCR en una PCR combinada. En una reacción de amplificación combinada, cada producto de expresión génica individual debe competir por los componentes de reacción durante la PCR, de modo que los productos de genes altamente expresado, que están presentes en una elevada cantidad de copias en el inicio de la reacción de PCR, efectivamente evitan la amplificación de los productos génicos de bajo número de copias secuestrando los componentes de reacción vitales. Esto produce una combinación de productos génicos amplificados que puede representar solamente una pequeña cantidad de genes altamente expresados. El análisis de estos productos se complica adicionalmente por la enorme variación que sucede entre experimentos replicados haciendo que la cuantificación precisa de la expresión génica sea muy difícil. Aunque la optimización de cebadores y componentes de reacción puede aliviar este problema en algún grado, normalmente implica experimentación extensiva y llega a ser mucho más difícil ya que la cantidad de genes a analizar en una reacción combinada se aumenta, de modo que cuatro genes normalmente sería el número máximo que podría analizarse de forma fiable en un sistema optimizado extensivamente. El análisis de expresión génica normalmente requiere que se estime la cantidad de cada expresión génica, que se complica adicionalmente en una PCR combinada.

Aproximaciones modernas a PCR combinada Las aproximaciones modernas a este problema incluyen el uso de sistemas de detección fluorogénicos tales como sondas Taqman® para detectar cada producto de expresión génica individualmente por unión a estas y liberando una fluorescencia detectable específica (Exner M. M., y Lewinski. M.A. (2002) ) . La sensibilidad de las reacciones de PCR a tiempo real combinadas, usando el LightCycler y el Sistema de Detección de Secuencia ABI PRISM 7700, depende de la concentración de la ADN polimerasa (Molecular and Cellular Probes. Oct. 2002; 16 (5) :351-7) . Estas sondas y sus usos se describen en las patentes de Estados Unidos Nº : 5.210.015; 5.487.972; 5.804.375; 5.994.056;

5.538.848 y 6.030.787. Esto requiere una máquina de ciclado térmico a tiempo real que tenga múltiples canales para detectar fluorescencia a diferentes longitudes de onda. Además, las sondas Taqman® son caras de adquirir y también pueden limitar la región particular de secuencia que puede analizarse debido a las necesidades específicas de secuencia para la unión de la sonda.

Otras aproximaciones fluorogénicas incluyen el uso de sistemas de detección genéricos tales como el colorante SYBR-green, que emite fluorescencia cuando se intercala con el ADN amplificado de cualquier producto de

expresión génica como se describe en las patentes de Estados Unidos Nº : 5.436.134 y 5.658.751. Journal of Medical Microbiology (2003) 52, 681-683 describe un método de amplificación doble que incluye una PCR anidada que permite la detección cualitativa de dos dianas. Aunque el SYBR-green es barato de usar y tiene excelentes propiedades fluorogénicas normalmente no es apropiado para estimar el nivel de expresión génica en una PCR combinada ya que la fuente de fluorescencia, con respecto a cada producto génico, no puede determinarse fiablemente.

Independientemente del uso de sondas fluorogénicas o colorante SYBR-green como sistema de detección, la PCR combinada aún sufre el mismo problema en que los productos de expresión génica compiten por los componentes de reacción, impidiendo de este modo la cuantificación precisa de expresión génica de múltiples genes.

Aproximación de alto rendimiento Una aproximación alternativa a las mediciones de expresión génica combinadas incluye el uso de microseries. Las microseries pueden usarse para cuantificar la expresión de miles de genes simultáneamente. Sin embargo, las microseries normalmente requieren una formación extensiva del operario, grandes cantidades de ARN de muestra, y un equipo caro. Además, aunque la cantidad de genes que puede analizarse es grande, la cuantificación resultante de expresión génica es mucho menos precisa, conduciendo a menudo a falsos positivos.

Por tanto, existe la necesidad de un método simple y barato que sea adecuado para usar en cualquier entorno en que se requiera la cuantificación precisa de la expresión de múltiples genes o donde se requiera la detección de ácidos nucleicos específicos o donde se requiera la producción de múltiples productos de ácido nucleico. La invención es particularmente adecuada para la amplificación y detección de ácidos nucleicos de muestras muy pequeñas tales como manchas de sangre, muestras de microscopia de disección laser, células individuales y muestras que contengan ácidos nucleicos parcialmente fragmentados tales como aquellas tomadas de muestras envejecidas y secciones incorporadas en parafina fijadas en formalina (FFPE) . Sin embargo, los métodos de la invención son igualmente aplicables a muestras más grandes y también a aquellas de alta calidad. Ejemplos de entornos en que podría ser útil la invención incluyen, aunque sin limitación: diagnóstico; pronóstico; técnicas forenses; ensayo y control ambiental y de productos; detección de armas biológicas; investigación y similares.

Por lo tanto un objetivo de la presente invención es superar o mejorar al menos una de las desventajas de la técnica previa, o proporcionar una alternativa útil.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a métodos de amplificación y cuantificación de ácidos nucleicos y en particular a métodos mejorados para amplificar y cuantificar o identificar una pluralidad de productos de expresión génica para uso de diagnóstico, uso forense y uso en investigación. Los métodos son particularmente aplicables a la cuantificación o identificación de expresión... [Seguir leyendo]

1. Un método para amplificar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas a partir de una combinación de moléculas de ácido nucleico, que comprende:

(a) amplificar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas en una reacción combinada de primera ronda que incluye una pluralidad de pares de cebadores externos, siendo cada par específico para una secuencia de ácido nucleico seleccionada, en donde la reacción de amplificación combinada amplifica más de aproximadamente 4 moléculas de ácido nucleico seleccionadas y en donde la reacción combinada de primera ronda se deja proceder durante hasta aproximadamente 15 ciclos;

(b) diluir los amplicones y los componentes restantes de reacción de dicha reacción combinada de primera ronda en una pluralidad de reacciones de amplificación de segunda ronda incluyendo cada una al menos un par de cebadores internos, siendo cada par específico para una de dichas secuencias de ácido nucleico seleccionadas, en donde dicha dilución es tal que la cantidad de cebadores externos introducida en cada una de dichas reacciones de amplificación de segunda ronda es insuficiente para alterar la amplificación de dichas moléculas de ácido nucleico seleccionadas usando dichos cebadores internos y en donde la dilución es una dilución de al menos un factor 25; y

(c) amplificar adicionalmente dichas moléculas de ácido nucleico seleccionadas en dicha pluralidad de reacciones de amplificación de segunda ronda, mediante lo cual cada reacción de segunda ronda amplifica adicionalmente un subconjunto de dicha pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas respectivamente a partir de dichos cebadores internos.

2. Un método para amplificar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas a partir de una combinación de moléculas de ácido nucleico que comprende:

(a) amplificar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas en una reacción combinada de primera ronda que incluye una pluralidad de pares de cebadores de primera ronda que comprende cebadores externos, siendo cada par específico para una secuencia de ácido nucleico seleccionada, en donde la reacción de amplificación combinada amplifica más de aproximadamente 4 moléculas de ácido nucleico seleccionadas y en donde la reacción combinada de primera ronda se deja proceder durante hasta aproximadamente 15 ciclos;

(b) diluir los amplicones y los componentes restantes de reacción de dicha reacción combinada de primera ronda en una pluralidad de reacciones de amplificación de segunda ronda incluyendo cada una al menos un par de cebadores de segunda ronda, comprendiendo cada par un cebador interno y uno de dichos cebadores externos y siendo específico para una de dichas secuencias de ácido nucleico seleccionadas, en donde dicha dilución es tal que la cantidad de cebadores externos introducida en cada una de dichas reacciones de amplificación de segunda ronda es insuficiente para alterar la amplificación de dichas moléculas de ácido nucleico seleccionadas usando dichos cebadores de segunda ronda y en donde la dilución es una dilución de al menos un factor 25; y

(c) amplificar adicionalmente dichas moléculas de ácido nucleico seleccionadas en dicha pluralidad de reacciones de amplificación de segunda ronda mediante lo cual cada reacción de segunda ronda amplifica adicionalmente un subconjunto de dicha pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas respectivamente a partir de dichos cebadores de segunda ronda.

3. Un método para estimar la cantidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas a partir de una combinación de moléculas de ácido nucleico que comprende:

(a) amplificar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas en una reacción combinada de primera ronda que incluye una pluralidad de pares de cebadores externos siendo cada par específico para una secuencia de ácido nucleico seleccionada en donde la reacción de amplificación combinada amplifica más de aproximadamente 4 moléculas de ácido nucleico seleccionadas y en donde la reacción combinada de primera ronda se deja proceder durante hasta aproximadamente 15 ciclos;

(b) diluir los amplicones y componentes restantes de reacción de dicha reacción combinada de primera ronda en una pluralidad de reacciones de amplificación de segunda ronda incluyendo cada una un indicador detectable y al menos un par de cebadores internos, siendo cada par específico para una de dichas secuencias de ácido nucleico seleccionadas, en donde dicha dilución es tal que la cantidad de cebadores externos introducida en cada una de dichas reacciones de amplificación de segunda ronda es insuficiente para alterar la amplificación de dichas moléculas de ácido nucleico seleccionadas usando dichos cebadores internos y en donde la dilución es una dilución de al menos un factor 25;

(c) amplificar adicionalmente dichas moléculas de ácido nucleico seleccionadas en dicha pluralidad de reacciones de amplificación de segunda ronda mediante lo cual cada reacción de segunda ronda amplifica adicionalmente un subconjunto de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas respectivamente a partir de dichos cebadores internos; y

(d) controlar cada reacción de amplificación de segunda ronda mediante dicho indicador detectable de modo que se estime la cantidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas de cada secuencia seleccionada.

4. Un método para estimar la cantidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas a partir de una combinación de moléculas de ácido nucleico que comprende:

(a) amplificar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas en una reacción combinada de primera ronda que incluye una pluralidad de pares de cebadores externos siendo cada par específico para una secuencia de ácido nucleico seleccionada, en donde la reacción de amplificación combinada amplifica más de aproximadamente 4 moléculas de ácido nucleico seleccionadas y en donde la reacción combinada de primera ronda se deja proceder durante hasta aproximadamente 15 ciclos;

(b) diluir los amplicones y componentes restantes de reacción de dicha reacción combinada de primera ronda en una pluralidad de reacciones de amplificación de segunda ronda incluyendo cada una un indicador detectable y al menos un par de cebadores de segunda ronda, comprendiendo cada par un cebador interno y uno de dichos cebadores externos y siendo específico para una de dichas secuencias de ácido nucleico seleccionadas, en donde dicha dilución es tal que la cantidad de cebadores externos introducida en cada una de dichas reacciones de amplificación de segunda ronda es insuficiente para alterar la amplificación de dichas moléculas de ácido nucleico seleccionadas usando dichos cebadores de segunda ronda y en donde la dilución es una dilución de al menos un factor 25;

(c) amplificar adicionalmente dichas moléculas de ácido nucleico seleccionadas en dicha pluralidad de reacciones de amplificación de segunda ronda mediante lo cual cada reacción de segunda ronda amplifica adicionalmente un subconjunto de dicha pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas respectivamente; y

(d) controlar cada reacción de amplificación de segunda ronda mediante dicho indicador detectable de modo que se estime la cantidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas de cada secuencia seleccionada.

5. Un método para estimar la cantidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas a partir de una combinación de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3 o con la reivindicación 4 en donde dicho indicador fluorogénico es un colorante que se intercala en ADN bicatenario.

6. Un método para estimar la cantidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas a partir de una combinación de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3 o con la reivindicación 4 en donde dicho indicador fluorogénico es una sonda fluorogénica que interacciona con ADN monocatenario.

7. Un método para estimar la cantidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas a partir de una combinación de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3 o con la reivindicación 4 en donde dicha reacción de amplificación de segunda ronda incluye una pluralidad de pares de cebadores y una pluralidad de sondas fluorogénicas de modo que se amplifique y cuantifique una pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas de cada secuencia seleccionada.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que dichas moléculas de ácido nucleico incluyen moléculas de ADN.

9. Un método para amplificar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que dichos cebadores incluidos en dicha reacción de amplificación de segunda ronda tienen una Tm mayor que al menos uno de dichos cebadores externos incluidos en dicha reacción de amplificación de primera ronda, de modo que dicho cebado oligonucleotídico en dicha reacción de amplificación de segunda ronda se desvíe sustancialmente a favor de dichos cebadores que tienen dicha Tm mayor.

10. Un método para amplificar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que al menos uno de dichos cebadores externos incluye nucleótidos UTP mediante lo cual dicho cebador es susceptible a digestión por una enzima UNG.

11. Un método para amplificar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas de acuerdo con la reivindicación 10 en el que dichos cebadores externos se retiran al final de dicha primera ronda de amplificación por digestión con una enzima UNG evitando de este modo sustancialmente la contaminación de dicha reacción de amplificación de segunda ronda por dichos cebadores de primera ronda.

12. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la reacción de amplificación combinada amplifica entre aproximadamente 4 y 150 moléculas de ácido nucleico seleccionadas.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12 en el que la reacción de amplificación combinada amplifica entre aproximadamente 10 y 150 moléculas de ácido nucleico seleccionadas.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13 en el que la reacción de amplificación combinada amplifica entre aproximadamente 20 y 100 moléculas de ácido nucleico seleccionadas.

15. Un método para amplificar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores cuando se usa en un método para detectar polimorfismos, mutaciones, inserciones y deleciones.

16. Un método para amplificar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores cuando se usa en un método de diagnóstico de enfermedades y trastornos.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16 cuando se usa para el diagnóstico de una neoplasia.

18. Un método de acuerdo con la reivindicación 17 en el que dicha neoplasia es cáncer de mama.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 17 en el que dicha neoplasia es cáncer colorrectal. 10

20. Un método para amplificar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico seleccionadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 cuando se usa para la detección e identificación de organismos seleccionados.

21. Un método de acuerdo con la reivindicación 20 en el que dichos organismos se detectan e identifican secuenciando dichos productos de ácido nucleico.

22. Un método de acuerdo con la reivindicación 20 o con la reivindicación 21 en el que dichos organismos se seleccionan entre el grupo de bacterias, virus, hongos, micoplasma y parásitos o combinaciones de los mismos. 20

23. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, en el que dicho método incluye análisis de curvas de fusión.

24. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicha curva de fusión se genera teniendo una 25 resolución en el intervalo de aproximadamente 0, 05 º C a aproximadamente 0, 02 º C.

25. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicha curva de fusión se genera teniendo una resolución de menos de 0, 02 º C.

26. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que las reacciones de amplificación se procesan automáticamente en un aparato termociclador.

27. Un método de acuerdo con la reivindicación 26 en el que dicho aparato termociclador es un aparato termociclador a tiempo real de múltiples pocillos. 35

28. Un método de acuerdo con la reivindicación 26 en el que dicho aparato termociclador es un dispositivo de PCR de flujo continuo.

29. Un método de acuerdo con la reivindicación 26 en el que dicho aparato termociclador es un aparato 40 termociclador rotario.