Métodos para el enriquecimiento de secuencias basadas en solución y análisis de regiones genómicas.

Un método para aislar y reducir la complejidad de una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprende:

a) proporcionar:

i) un soporte sólido que comprende sondas de hibridación que pueden hibridarse con secuencias de ácido nucleico diana,

ii) una muestra de ácido nucleico que comprende las secuencias de ácidos nucleicos diana,

b) amplificar dichas sondas de hibridación de forma que los productos de amplificación comprendan una porción de unión y en el que dichos productos de amplificación se mantengan en solución,

c) hibridar dicha muestra de ácido nucleico a dichos productos de amplificación en solución de forma que se permita que se produzca la hibridación entre dichos productos de amplificación y las secuencias de ácidos nucleicos diana,

d) separar los complejos de hibridación de los ácidos nucleicos diana / producto de amplificación de los ácidos nucleicos hibridados no específicamente mediante dicha matriz de unión, y

e) eluir las secuencias de ácido nucleico diana hibridadas del complejo, aislandolo de este modo y reduciendo la complejidad de una pluralidad de secuencias de ácido nucleico.

Métodos para el enriquecimiento de secuencias basadas en solución y análisis de regiones genómicas CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente solicitud se refiere al campo del enriquecimiento y análisis de secuencias de ácidos nucleicos por medio de la captura de dichas secuencias sobre un soporte sólido. Más precisamente, la presente invención proporciona un nuevo método para capturar regiones genómicas específicas para el posterior análisis adicional, si la región de interés es demasiado grande para ser amplificada por sólo una o unas pocas reacciones de PCR. En particular, la presente invención proporciona para el enriquecimiento de secuencias específicas en un formato basado en solución.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El advenimiento de la tecnología de microchips de ácidos nucleicos, por ejemplo la tecnología de microchips de DNA, hace que sea posible construir una matriz de millones de secuencias de ácido nucleico, por ejemplo secuencias de DNA, en un área muy pequeña, por ejemplo en un portaobjetos de microscopio (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos núm. 6.375.93 y 5.143.854). Inicialmente, dichas matrices se crearon mediante la detección de secuencias de DNA previamente sintetizadas sobre portaobjetos. Sin embargo, la construcción de sintetizadores de chips sin máscara (MAS) en los que la luz se utiliza para la síntesis directa de las secuencias de DNA, la dirección de la luz se realiza usando un dispositivo de microespejo digital (DMD) tal como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 6.375.93 que ahora permite la síntesis in situ de secuencias de oligonucleótidos directamente en el portaobjetos.

Al utilizar un instrumento MAS, la selección de secuencias de oligonucleótidos o secuencias de DNA que se construirán en el microchip se encuentra bajo el control de un programa de tal manera que ahora es posible crear chips personalizados de forma individual en base a las necesidades particulares de un investigador. En general, la tecnología de síntesis de DNA o microchips de oligonucleótidos basados en MAS permite la síntesis en paralelo de millones de características únicas de oligonucleótidos en un área muy pequeña de un portaobjetos de microscopio estándar. Los microchips se sintetizan generalmente mediante el uso de la luz para dirigir qué oligonucleótidos son sintetizados en lugares específicos en un chip, estos lugares se llaman características.

Con la disponibilidad de los genomas completos de cientos de organismos, para los que una secuencia de referencia ha sido generalmente depositada en una base de datos pública, se han utilizado microchips para llevar a cabo análisis de secuencias de ácidos nucleicos o DNA aislados de una gran variedad de organismos.

La tecnología de ácido nucleico o de microchips de DNA se ha aplicado a muchas áreas de investigación y diagnóstico, como la expresión y el descubrimiento de genes, la detección de mutaciones, comparación de secuencias alélicas y evolutivas, la cartografía del genoma, el descubrimiento de fármacos, y mucho más. Muchas aplicaciones requieren la búsqueda de variantes genéticas y mutaciones a través de todo el genoma humano que subyacen a enfermedades humanas. En el caso de enfermedades complejas, estas búsquedas generalmente resultan en un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) o un conjunto de SNP asociados con enfermedades y / o riesgo de enfermedad. La identificación de estos SNP ha demostrado ser una tarea ardua y muchas veces infructuosa porque se requiere la resecuenciación de grandes regiones de DNA genómico de las personas afectadas o muestras de tejido, por lo general superior a 1 kilobases (Kb), para encontrar un solo cambio de base o para identificar todas las variantes de la secuencia. Otras aplicaciones incluyen la identificación de las ganancias y pérdidas de secuencias cromosómicas que también pueden estar asociadas con el cáncer, como el linfoma (Martínez-Climent JA et al., 23, Blood 11: 319 - 3117), el cáncer gástrico (Weiss MM et al., 24, Cell. Oncol. 26: 37-317), el cáncer de mama (Callagy G et al., 25, J. Path. 25: 388-396) y el cáncer de próstata (París, PL et al., 24, Hum. Mol. Gen. 13: 133-1313). Como tal, la tecnología de microchips es una herramienta tremendamente útil para los investigadores científicos y clínicos en su comprensión de las enfermedades y la eficacia del régimen terapéutico en el tratamiento de estas enfermedades.

El genoma normalmente es demasiado complejo para ser estudiado como un todo, y deben utilizarse técnicas para reducir la complejidad del genoma. Para abordar este problema, una solución es reducir ciertos tipos de secuencias abundantes de una muestra de ácido nucleico o DNA genómico, como se describe en la patente de EE.UU. 6.13.44. Una alternativa es utilizar métodos y composiciones para el enriquecimiento de las secuencias genómicas como se describe, por ejemplo; en Albert et al. (27, Nat. Meth., 4: 93-5), Okou et al. (27, Nat. Meth. 4: 97-9), Olson M. (27, Nat. Meth. 4. 891-892), Hodges et al. (27, Nat. Genet. 39: 1522-1527) y como se muestra en la Solicitud de Patente de Estados Unidos con números de serie 11/6384, 11/97949 y 61/32594. Albert et al. describe una alternativa que es a la vez rentable y rápida en la reducción efectiva de la complejidad de una muestra genómica de una manera definida por el usuario para permitir su posterior procesamiento y análisis. Lovett et al. (1991, Proc. Nati. Acad. Sci. 88: 9628-9632) también describe un método para la selección genómica utilizando cromosomas artificiales bacterianos. Sin embargo, los métodos existentes están limitados, por ejemplo, por su facilidad de uso y la inflexibilidad de los materiales y métodos.

La tecnología de microchips previa, ya sea la tecnología de enriquecimiento u otra, suele ser una tecnología asociada al sustrato con una variabilidad Inherente, como portaobjetos de microchips, chips, y similares. La variabilidad puede tomar muchas formas, por ejemplo la variabilidad en el ruido de fondo, la cinética de hibridación / sonda, fuente de vidrio y similares. La variabilidad juega un papel importante en la interpretación experimental y puede definir el éxito o fracaso de un experimento.

Por lo tanto, lo que se necesita son métodos, sistemas y composiciones para proporcionar enriquecimiento de secuencias específicas en un formato de microchip que no sea el habitual de tipo sustrato. La aparición de nuevos formatos de microchips proporcionará herramientas adicionales para los investigadores y clínicos en el avance del conocimiento de las enfermedades y estados patológicos.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente descripción proporciona métodos y sistemas para la captura y el enriquecimiento de ácidos nucleicos diana y el análisis de los ácidos nucleicos diana enriquecidos. En particular, la presente descripción proporciona el enriquecimiento de secuencias específicas en un formato basado en solución. Los métodos y sistemas de la presente descripción son útiles para ayudar a los investigadores y clínicos en la identificación, el estudio y seguimiento de regímenes de tratamiento asociados con la enfermedad y estados de la enfermedad.

La presente descripción se resume como un nuevo método para reducir la complejidad de una gran muestra de ácidos nucleicos, tal como una muestra genómica, biblioteca de DNAc o RNAm o biblioteca de RNAm para facilitar su posterior procesamiento y análisis genético. Las realizaciones de la presente descripción comprenden sondas de ácido nucleico inmovilizadas (pre-seleccionadas) o no inmovilizadas para capturar las secuencias diana de ácidos nucleicos a partir de, por ejemplo, una muestra genómica mediante hibridación de la muestra a las sondas, o amplicones derivados de sonda, sobre un soporte sólido o en solución. Los ácidos nucleicos diana capturados son preferiblemente lavados y eluidos de las sondas. Las secuencias genómicas eluidas son más susceptibles de análisis genético detallado que una muestra que no ha sido sometida a los métodos descritos en el presente documento. La presente descripción proporciona métodos y sistemas para la captura y el enriquecimiento de ácidos nucleicos diana y el análisis de los ácidos nucleicos diana enriquecidos. En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona el enriquecimiento de secuencias específicas en un formato basado en solución. En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos y sistemas para la captura y el enriquecimiento de ácidos nucleicos diana basados en solución (por ejemplo, DNAgenómico, RNA, DNAc, RNAm, etc.).

Los métodos descritos proporcionan una aproximación rentable, flexible y eficiente para reducir la complejidad de una muestra genómica. Las muestras genómicas... [Seguir leyendo]

1. Un método para aislar y reducir la complejidad de una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprende:

a) proporcionar:

i) un soporte sólido que comprende sondas de hibridación que pueden hibridarse con secuencias de ácido nucleico diana,

ii) una muestra de ácido nucleico que comprende las secuencias de ácidos nucleicos diana,

b) amplificar dichas sondas de hibridación de forma que los productos de amplificación comprendan una porción de unión y en el que dichos productos de amplificación se mantengan en solución,

c) hibridar dicha muestra de ácido nucleico a dichos productos de amplificación en solución de forma que se permita que se produzca la hibridación entre dichos productos de amplificación y las secuencias de ácidos nucleicos diana,

d) separar los complejos de hibridación de los ácidos nucleicos diana / producto de amplificación de los ácidos nucleicos hibridados no específicamente mediante dicha matriz de unión, y

e) eluir las secuencias de ácido nucleico diana hibridadas del complejo, aislándolo de este modo y reduciendo la complejidad de una pluralidad de secuencias de ácido nucleico.

2. El método según la reivindicación 1, que comprende además la secuenciación de las secuencias de ácidos nucleicos diana eluidas.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho soporte sólido es un portaobjetos para microchip.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, en el que dicha muestra de ácido nucleico es una muestra de DNA genómico fragmentado.

5. El método según la reivindicación 4, en el que dicha muestra de DNA genómico fragmentado comprende además moléculas adaptadoras en uno o ambos extremos de los fragmentos de la muestra de DNA genómico.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, en el que dichas sondas de hibridación comprenden además secuencias de unión de cebadores en uno o ambos extremos de dichas sondas.

7. El método según la reivindicación 6, en el que dichas secuencias de unión cebador, cuando están presentes en ambos extremos de las sondas, son ¡guales.

8. El método según la reivindicación 7, en el que dichas secuencias de unión cebador, cuando están presentes en ambos extremos de las sondas, son diferentes.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8, en el que dicha amplificación comprende una reacción en cadena de pollmerasa exponencial.

1. El método según la reivindicación 9, en el que dicha amplificación comprende, además, una reacción en cadena de la pollmerasa asimétrica.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 1, en el que dicha porción de unión es una porción de unión a biotina.

12. El método según la reivindicación 11, en el que dicha separación comprende la unión de dicha porción de unión a biotina a un sustrato recubierto con estreptavidina.

13. El método según la reivindicación 12, en el que dicho sustrato recubierto con estreptavidina es una partícula paramagnética recubierta con estreptavidina.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 13, que comprende además el lavado de dichos complejos de hibridación del producto de amplificación / ácidos nucleicos diana separados antes de la elución.

15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 14, en el que dicha población de moléculas de ácido nucleico o dicha pluralidad de secuencias de ácido nucleico contiene todo el genoma o al menos un cromosoma de un organismo, o de al menos una molécula de ácido nucleico con un tamaño de al menos aproximadamente 2 kb, al menos aproximadamente 5 kb, al menos aproximadamente 1 Mb, al menos

aproximadamente 2 Mb o al menos aproximadamente 5 Mb, especialmente un tamaño entre aproximadamente 1 kb y alrededor de 5 Mb, entre aproximadamente 2 kb y alrededor de 5 Mb, entre alrededor de 5 kb y aproximadamente 5 Mb, entre alrededor de 1 Mb y 2 Mb, o aproximadamente entre 2 Mb y unos 5 Mb.

16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 4 a 15, en el que dichas sondas se seleccionan

de:

- una pluralidad de sondas que definen una pluralidad de exones, intrones o secuencias reguladoras de una pluralidad de loci genéticos,

- una pluralidad de sondas que definen la secuencia completa de al menos un locus genético único, y dicho locus tiene un tamaño de al menos 1 kb, preferiblemente al menos 1 Mb, o al menos uno de los tamaños que se especifican en la reivindicación 3,

- una pluralidad de sondas que definen puntos que se conoce contienen polimorfismos de un único nucleótido (SNP), o

- una pluralidad de sondas que definen un chip, en particular un chip de secuencias contiguas, diseñado para capturar la secuencia completa de al menos un cromosoma completo.

17. Un método para determinar la información de una secuencia de ácido nucleico de al menos una región de ácido nucleico, en particular de ácido nucleico genómico, y el método comprende los pasos de:

1. reducir la complejidad genética de una población de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con un método de acuerdo con una de las reivindicaciones de 1 a 16, y

2. determinar la secuencia de ácido nucleico de las moléculas capturadas, en particular mediante la realización de una secuenciación mediante reacciones de síntesis.

18. Un método para detectar la variación en la región de codificación en relación a un genoma de referencia, que comprende el método las etapas:

1. reducir la complejidad genética de una población de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con un método de acuerdo con una de las reivindicaciones de 1 a 16,

2. la determinación de la secuencia de ácido nucleico de las moléculas capturadas, y

3. comparar la secuencia determinada con las secuencias en una base de datos del genoma de referencia, en particular, con las secuencias en una base de datos de polimorfismos en el genoma de referencia para identificar las variantes del genoma de referencia.