Métodos para detectar la presencia de patógenos intracelulares.

Proceso para detectar la presencia de un primer patógeno intracelular en una muestra biológica,

que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto la muestra con una población de células en presencia de un agente inhibidor, en el que dicho agente inhibe específicamente la reproducción de un segundo patógeno intracelular que se sabe está presente en la muestra;

(ii) incubar las células en condiciones que permitan la reproducción de dicho primer patógeno intracelular, mientras se inhibe la reproducción del segundo patógeno intracelular mediante la presencia del agente inhibidor; y

(iii) ensayar el material que surge de la etapa (ii) para detectar la presencia de dicho primer patógeno intracelular mediante microscopía electrónica de transmisión, un ensayo bioquímico basado en la transcripción inversa para retrovirus, la detección de un efecto citopático, un ensayo genético molecular basado en PCR, un ensayo de inoculación en animales o infección de huevos embrionados.

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a métodos para el estudio de patógenos intracelulares en muestras biológicas. Más concretamente, la Invención se refiere a métodos de estudio de muestras biológicas que contienen más de un patógeno ¡ntracelular, y a métodos de observación o de ensayo para detectar la presencia de un primer patógeno ¡ntracelular en presencia de un segundo patógeno ¡ntracelular.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Puede ser de interés estudiar dos patógenos intracelulares diferentes en la misma muestra biológica, por ejemplo una muestra aislada de un paciente o de un cultivo celular, u observar un patógeno ¡ntracelular en presencia de otros patógenos intracelulares. Sin embargo, con frecuencia la presencia de uno de tales patógenos interfiere con las observaciones de otros patógenos.

Por ejemplo, cuando se estudian los efectos de patógenos intracelulares en ensayos que conducen a resultados fenotípicos generales ("ensayos fenotípicos"), las características observables no son necesariamente específicas de un patógeno concreto. Por ejemplo en virología, una placa observada en un cultivo celular puede no atribuirse necesariamente a un virus determinado si también está presente otro patógeno capaz de provocar tales placas.

En las Referencias D1 y D2 se describe el uso de un enfoque con ARN de interferencia (ARNi) para mostrar que la infección individual, así como la conjunta, por el virus respiratorio sincicial (VRS) y el virus de la parainfluenza (PIV) puede impedirse e inhibirse específicamente mediante ARN de interferencia pequeños (ARNip), instilados por vía ¡ntranasal en un ratón infectado con ambos virus. Como no hay una manera fácil de determinar las unidades formadoras de placas de cada virus en una mezcla de los dos, se utilizó la microscopía de inmunofluorescencia después de una doble tinción de secciones de tejido pulmonar con una mezcla de anticuerpos contra VRS y contra HPIV3 para detectar ambos virus.

En la Referencia D3 se muestra que los ARNip específicos para regiones conservadas del genoma del virus de la gripe A pueden Inhibir potentemente la producción de virus de la gripe en líneas celulares y en huevos embrionados de pollo.

Suele resultar deseable emplear ensayos fenotípicos generales. Otros métodos más específicos de observación de patógenos tienen diferentes inconvenientes. Con frecuencia, los métodos más específicos no son tan sencillos ni rápidos de realizar. Estos otros métodos también pueden requerir reactivos específicos que imponen limitaciones adicionales.

Los ensayos inmunológicos, por ejemplo, requieren la disponibilidad de anticuerpos. La utilidad de los enfoques inmunológicos puede estar limitada adicionalmente cuando los anticuerpos presentan reacción cruzada para múltiples patógenos que pueden estar presentes en la muestra. Para algunos fines de diagnóstico, puede ser deseable una amplia reactividad cruzada de los anticuerpos contra patógenos relacionados. Por otro lado, tal reactividad cruzada puede hacer que sea imposible estudiar patógenos relacionados y coexistentes de manera independiente mediante métodos inmunológicos.

Los ensayos basados en PCR para detectar la presencia de patógenos pueden ser más específicos. Sin embargo, los métodos basados en PCR requieren el conocimiento de secuencias genómicas para cada patógeno de interés. Deben diseñarse y optimizarse cebadores para cada patógeno de interés,

El requisito de anticuerpos o cebadores específicos limita la flexibilidad de los métodos inmunológicos y basados en PCR, y, en particular, su utilidad para observar patógenos cuando no se conoce la naturaleza del patógeno. La utilidad de estos métodos específicos puede además verse limitada en el caso de patógenos de desarrollo rápido, por ejemplo, determinados virus, porque pueden producirse mutaciones en los epítopos reconocidos por los anticuerpos o en las secuencias reconocidas por los cebadores de PCR.

Es un objeto de la invención proporcionar métodos adicionales y mejorados para estudiar patógenos intracelulares de interés en una muestra biológica independientemente de otros patógenos intracelulares.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un proceso de ensayo para detectar la presencia de un primer patógeno ¡ntracelular en una muestra biológica, que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto la muestra con una población de células en presencia de un agente Inhibidor, en el que dicho agente Inhibe específicamente la reproducción de un segundo patógeno intracelular que se sabe está presente en la muestra;

(¡i) Incubar las células en condiciones que permitan la reproducción de dicho primer patógeno Intracelular, mientras se Inhibe la reproducción del segundo patógeno Intracelular mediante la presencia del agente Inhibidor;

y

(i¡¡) ensayar el material que surge de la etapa (¡i) para detectar la presencia de dicho primer patógeno Intracelular mediante microscopía electrónica de transmisión, un ensayo bioquímico basado en la transcripción inversa para retrovlrus, la detección de un efecto citopático, un ensayo de genética molecular basado en PCR, un ensayo de inoculación en animales o la infección de huevos embrionados.

Según los métodos de la invención, las muestras biológicas pueden ensayarse rápidamente. La invención permite ensayar las muestras biológicas para detectar patógenos ¡ntracelulares de manera simple y directa, por ejemplo, mediante un ensayo fenotípico general, y permite estudiar un patógeno Intracelular de Interés Independientemente de la presencia (presunta o real) en la muestra de un patógeno Intracelular adicional que conduciría al mismo, equivalente o similar resultado en tales ensayos.

La invención también permite ensayar muestras biológicas para detectar patógenos ¡ntracelulares en circunstancias

- en las que se desconoce la presencia en la muestra del primer patógeno intracelular, y/o

- en las que se desconocen las secuencias genómicas del primer patógeno intracelular, y/o

- en las que no se dispone de los anticuerpos contra los patógenos ¡ntracelulares primero o segundo, y/o

- no se emplea un anticuerpo contra el segundo patógeno intracelular,

- en las que los anticuerpos contra dos o más patógenos ¡ntracelulares en la muestra presentan reacción cruzada, y/o

- se desea obtener rápidamente resultados de ensayo.

Los procesos de la invención abarcan formas de realización en las que un resultado de ensayo de la etapa (i¡¡) se obtiene en 12 meses, o, por ejemplo, en 9 meses, 8 meses, 7 meses, 6 meses, 5 meses, 4 meses, 3 meses, 2 meses, 1 mes, 4 semanas, 3 semanas, 2 semanas, 1 semana, 6 días, 5 días, 4 días, 3 días, 2 días, 1 día, o antes.

Patógenos intracelulares de los métodos de la invención

Los patógenos ¡ntracelulares primero y segundo de los métodos de la invención pueden abarcar uno o más patógenos ¡ntracelulares seleccionados de entre un procariota (es decir, una bactería/bacterías), un eucaríota (incluido un protozoo/protozoos o un hongo/hongos), y/o uno o más virus. El primer patógeno intracelular es diferente del segundo patógeno intracelular. Los patógenos primero y segundo pueden diferir en cualquier aspecto que les permita ser inhibidos de manera diferenciada. Por ejemplo, pueden diferir en el orden, la familia, el género, la especie, la subespecie y/o la cepa.

El primer patógeno intracelular puede ser un procariota, un eucariota y/o un virus. Preferentemente, el primer patógeno intracelular es un virus.

El segundo patógeno intracelular puede ser un procariota, un eucariota y/o un virus. Preferentemente, el segundo patógeno intracelular es un virus.

La invención abarca diversos tipos de ensayos, por ejemplo, en una forma de realización, el primer patógeno intracelular comprende un procariota (por ejemplo, uno o más de los procariotas preferentes que se enumeran más adelante), un eucariota (por ejemplo, uno o más de los eucariotas preferentes que se enumeran más adelante) y/o un virus (por ejemplo, uno o más de los virus preferentes que se enumeran más adelante), y el segundo patógeno intracelular comprende un procariota (por ejemplo, uno o más de los procariotas preferentes que se enumeran más adelante).

En una forma de realización adicional, el primer patógeno intracelular comprende un procariota (por ejemplo, uno o más de los procariotas que se enumeran más adelante), un eucariota (por ejemplo, uno o más de los eucariotas que se enumeran más adelante) y/o un virus (por ejemplo, uno o más de los virus que se enumeran más adelante), y el segundo patógeno... [Seguir leyendo]

1. Proceso para detectar la presencia de un primer patógeno intracelular en una muestra biológica, que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto la muestra con una población de células en presencia de un agente inhibidor, en el que dicho agente Inhibe específicamente la reproducción de un segundo patógeno Intracelular que se sabe está presente en la muestra;

(¡I) Incubar las células en condiciones que permitan la reproducción de dicho primer patógeno Intracelular, mientras se Inhibe la reproducción del segundo patógeno Intracelular mediante la presencia del agente Inhibidor;

y

(¡II) ensayar el material que surge de la etapa (¡i) para detectar la presencia de dicho primer patógeno Intracelular mediante microscopía electrónica de transmisión, un ensayo bioquímico basado en la transcripción Inversa para retrovlrus, la detección de un efecto citopático, un ensayo genético molecular basado en PCR, un ensayo de inoculación en animales o Infección de huevos embrionados.

2. Proceso según la reivindicación 1, en el que dicho primer patógeno comprende un procariota, un eucaríota y/o un virus.

3. Proceso según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho segundo patógeno comprende un procaríota, un eucaríota y/o un virus.

4. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho segundo patógeno comprende un virus.

5. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho primer patógeno comprende uno o más patógenos seleccionados de entre Bartonella, Bordetella, Brucella, Chlamydiae, Chlamydia, Chlamydophila, Ehrlichia, Escheríchia, Francisella, Legionella, Listeria, Mycobacterium, Rickettsiae, Salmonella, Shigella, Streptococcus, Yersinia, Babesia, Cryptococcus, Cryptosporidium, Eimeria, Histoplasma, Leishmania, Plasmodium, Theileria, Toxoplasma, Trypanosoma, Pneumovirínae, el género Pneumovirus, el virus respiratorio sincicial (VRS), morblllvlrus de la familia Paramyxovirídae, el virus del sarampión, enterovirus de la familia Picomaviridae, virus Coxsackie, echovirus y enterovirus, Reoviridae de mamíferos, Reoviridae aviar, ortorreovirus, rotavirus, metaneumovirus de la familia Paramyxovirídae, metaneumovirus humano (HMPV), rubulavirus de la familia Paramyxovirídae, virus de la parotiditis, Togaviridae, Rubellavirus, Coronaviridae, coronavirus humanos, coronavirus del SARS, rinovirus de la familia Picomaviridae, cepas M de Rhinovirus, virus de la varicela zoster (VZV), virus del herpes humano 2 (HHV3), Polyomaviridae, pollomavlrus SV-4, el pollomavlrus BK, poliomavirus JC, circovirus porcinos, picornavirus porcinos, virus de la enfermedad vesicular porcina (SVDV), virus de Teschen-Talfan, parvovirus, parvovirus canino (CPV), parvovirus porcinos, Bocavirus, Orthomyxoviridae, en particular virus de la gripe, por ejemplo, virus de la gripe A, virus de la gripe B y virus de la gripe C, virus de la parainfluenza (PIV), Paramyxovirídae paramyxovirinae, virus de la parainfluenza tipo 1, virus de la parainfluenza tipo 2, virus de la parainfluenza tipo 3, virus de la parainfluenza tipo 4, virus de la parainfluenza tipo 5, Herpesviridae, virus del herpes simple 1 y 2, Adenoviridae, adenovirus, adenovirus humano y de simio, circovirus aviares, Birnaviridae, virus de la bursitis infecciosa (también conocido como virus de Gumboro).

6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho segundo patógeno comprende un patógeno según la reivindicación 5.

7. Proceso según la reivindicación 1, en el que se desconoce si el primer patógeno intracelular está presente en la muestra biológica a ensayar.

8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el segundo patógeno intracelular es un virus.

9. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que una o ambas de dichas muestras biológicas y dicha población de células comprenden o provienen de células de mamífero.

1. Proceso según la reivindicación 9, en el que dichas células de mamífero comprenden una o más de entre células de hámster, vaca, primate, ser humano, mono y perro.

11. Proceso según las reivindicaciones 9 ó 1, en el que dichas células de mamífero comprenden una o más de entre células renales, fibroblastos, células de la retina, células hepáticas, células pulmonares.

12. Proceso según la reivindicación 9, en el que dichas células de mamífero son células MDCK.

13. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente inhibidor comprende un compuesto oligomérico.

14. Proceso según la reivindicación 14, en el que dicho compuesto oligomérico es capaz de apareamiento de bases complementarias con una secuencia nucleotídica presente en, codificada por y/o transcrita a partir del genoma del segundo patógeno intracelular.

15. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho compuesto oligomérico actúa mediante ARNi para inhibir la reproducción del segundo agente intracelular.

16. Proceso según la reivindicación 15, en el que el agente que comprende dicho compuesto oligomérico es

bicatenario.

17. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el agente inhibidor es un antifúngico.

18. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el agente inhibidor es un antiviral.

19. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-14 en el que el agente inhibidor es un antibacteriano.

2. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que un resultado de ensayo de la etapa (iii) se

obtiene en 12 meses.