Métodos mejorados de genética inversa para la recuperación de virus.

Método de preparación de un virus que comprende las etapas de (i) transfección de un cultivo de células hospedadoras con al menos un constructo de expresión que codifica una molécula de ARN viral,

(ii) adición de células a las células hospedadoras transfectadas de (i) para proporcionar una mezcla de células, en el que las células hospedadoras y las células añadidas después de la transfección son de la misma línea celular, y (iii) cultivo de la mezcla de células con el fin de producir un virus.

Métodos mejorados de genética inversa para la recuperación de virus

CAMPO TÉCNICO

La presente invención pertenece al campo de la genética inversa. Además, se refiere a la fabricación de vacunas para la protección frente a diversos virus.

TÉCNICA ANTERIOR

La genética inversa permite la expresión recombinante y la manipulación de virus de ARN en un cultivo celular. Es una potente herramienta en virología y en la fabricación de vacunas, ya que permite la rápida producción de virus recombinantes (incluidos los reordenates) y/o su mutación. El método implica la transfección de células hospedadoras con uno o más constructos de expresión que codifican el genoma viral y el aislamiento del virus a partir de las células.

En Whiteley et al. (Influenza Other Respi Viruses. Julio de 2007; 1 (4) :157-66) , el documento WO2005/062820, Koudstaal et al. (Vaccine. Abril de 2009 28;27 (19) :2588-93) y el documento US2008/124803 se describen métodos de producción de virus de la gripe en los que se transfectan células con constructos de expresión y se añaden, después de la transfección, células que son de un tipo celular diferente al de las células transfectadas.

Un inconveniente de la recuperación de virus mediante genética inversa es que el proceso es ineficaz y con frecuencia da como resultado un rendimiento viral insatisfactorio. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad en la técnica de proporcionar métodos de genética inversa alternativos y más eficaces.

RESUMEN DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN PREFERENTES

Los autores de la invención han descubierto recientemente de manera sorprendente que la escasa eficacia de los métodos de genética inversa puede mejorarse significativamente transfectando las células con el constructo o los constructos de genética inversa y añadiendo posteriormente más células a las células transfectadas. Los autores de la invención suponen que el aumento de la eficacia observado se debe al hecho de que la transfección es perjudicial para las células. Por lo tanto, cualquier virus recuperado tiene que expandirse en células enfermas o esperar hasta que el virus se transfiere a células sanas. Esto da como resultado una pérdida de virus viables. La adición de células a las células hospedadoras transfectadas permite que el virus recuperado se multiplique en un sustrato de células sanas que aumenta significativamente el rendimiento viral.

En una forma de realización, la invención proporciona un método de preparación de un virus tal como se define en las reivindicaciones, que comprende las etapas de (i) transfección de un cultivo de células hospedadoras con al menos un constructo de expresión que codifica una molécula de ARN viral, (ii) adición de células a las células hospedadoras transfectadas de (i) para proporcionar una mezcla de células, y (iii) cultivo de la mezcla de células con el fin de producir los virus.

En una forma de realización adicional, la invención proporciona un método de preparación de un virus para la fabricación de vacunas tal como se define en las reivindicaciones, que comprende las etapas de (i) transfección de un cultivo de células hospedadoras con al menos un constructo de expresión que codifica una molécula de ARN viral, (ii) adición de células a las células hospedadoras transfectadas de (i) para proporcionar una mezcla de células,

(iii) cultivo de la mezcla de células con el fin de producir los virus, (iv) purificación del virus obtenido en la etapa (iii) , y opcionalmente (v) formulación del virus en una vacuna.

Genética inversa Puede utilizarse la genética inversa para producir una gran diversidad de virus de ARN, incluidos virus de ARN de cadena positiva [1, 2], virus de ARN de cadena negativa [3, 4] y virus de ARN bicatenario [5]. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método de producción de un virus recombinante en el que el virus se obtiene utilizando el método de genética inversa de la presente invención.

Los sistemas de genética inversa conocidos implican la expresión de moléculas de ADN que codifican las moléculas de ARN viral (ARNv) deseadas a partir de promotores de Pol I, promotores de la ARN polimerasa bacteriana, promotores de la polimerasa de bacteriófagos, etc. Además, cuando un virus necesita determinadas proteínas para formar un virus infeccioso, los sistemas también proporcionan estas proteínas, por ejemplo, el sistema comprende adicionalmente moléculas de ADN que codifican proteínas virales de manera que la expresión de ambos tipos de ADN conduzca al ensamblaje de un virus infeccioso completo.

Cuando se utiliza la genética inversa para la expresión de ARNv, resultará evidente para el experto en la materia que la separación precisa de los elementos de la secuencia uno con respecto al otro es fundamental para

que la polimerasa inicie la replicación. Por lo tanto, es importante que la molécula de ADN que codifica el ARN viral se coloque correctamente entre el promotor de Pol I y la secuencia de terminación, pero esta colocación está dentro de las capacidades de aquellos que trabajan con sistemas de genética inversa.

Generalmente, la genética inversa resulta adecuada para la expresión de cualquier tipo de virus que necesite la producción de ARN genómico durante su ciclo vital. Tales virus incluyen, pero no se limitan a, virus de ARN de cadena positiva y de cadena negativa, tales como los que se describen más adelante. Preferentemente, el virus es un ortomixovirus, por ejemplo, un virus de la gripe. Los métodos de la invención son adecuados además para los virus no segmentados, así como para los segmentados.

Cuando el virus es un virus de ARN de cadena positiva suele ser suficiente transfectar una célula con un constructo de expresión que comprenda el genoma viral. Por ejemplo, la transfección de plásmidos que contienen el genoma de poliovirus dio como resultado la recuperación de poliovirus infecciosos [1, 2]. La genética inversa para los virus de ARN de cadena negativa ha presentado más retos, ya que el ARN viral antisentido no suele ser infeccioso y necesita una ARN polimerasa para completar el ciclo vital. Por lo tanto, debe suministrarse la polimerasa viral, ya sea como proteína o como gen para la expresión de proteínas in situ.

Cuando el virus necesita una proteína para la infectividad, generalmente resulta preferente utilizar constructos de expresión bidireccionales ya que esto reduce el número total de constructos de expresión necesarios para la célula hospedadora. Por lo tanto, el método de la invención puede utilizar al menos un constructo de expresión bidireccional en el que un gen o ADNc se encuentra situado entre un promotor de Pol II cadena arriba y un promotor no endógeno de Pol I cadena bajo. La transcripción del gen o del ADNc a partir del promotor de Pol II produce un ARNm viral sentido con caperuza que puede traducirse a proteína, mientras que la transcripción a partir del promotor no endógeno de Pol I produce ARNv antisentido. El constructo de expresión bidireccional puede ser un vector de expresión bidireccional.

Con el fin de producir un virus recombinante, una célula debe expresar todos los segmentos del genoma viral que son necesarios para ensamblar un virión. El ADN clonado en los constructos de expresión de la presente invención proporciona preferentemente todo el ARN viral y todas las proteínas, pero también es posible utilizar un virus auxiliar para proporcionar algunos de los ARN y de las proteínas, aunque resultan preferentes los sistemas que no utilizan un virus auxiliar. Cuando el virus es un virus no segmentado, este puede conseguirse generalmente utilizando un único constructo de expresión en el método de la invención, a pesar de que también pertenece al alcance de la invención la expresión del genoma viral de virus no segmentados utilizando más de un constructo de expresión. Cuando el virus es un virus segmentado, el genoma viral suele expresarse utilizando más de un constructo de expresión en el método de la invención. Sin embargo, también se prevé la combinación de uno o más segmentos o incluso de todos los segmentos del genoma viral en un único constructo de expresión.

Los métodos de la invención son especialmente adecuados para producir cepas de virus reordenantes. La técnica puede utilizar la manipulación de plásmidos in vitro para generar combinaciones de segmentos virales, para facilitar la manipulación de las secuencias codificantes o no codificantes en los segmentos virales, para introducir mutaciones, etc. Resulta preferente el uso del sistema de expresión para la producción de cepas de virus reordenantes, ya que esto puede reducir significativamente el tiempo necesario para... [Seguir leyendo]

1. Método de preparación de un virus que comprende las etapas de (i) transfección de un cultivo de células hospedadoras con al menos un constructo de expresión que codifica una molécula de ARN viral, (ii) adición de células a las células hospedadoras transfectadas de (i) para proporcionar una mezcla de células, en el que las células hospedadoras y las células añadidas después de la transfección son de la misma línea celular, y (iii) cultivo de la mezcla de células con el fin de producir un virus.

2. Método de preparación de un virus que comprende las etapas de (i) transfección de un cultivo de células MDCK con al menos un constructo de expresión que codifica una molécula de ARN viral, (ii) adición de células MDCK a las células MDCK transfectadas de (i) para proporcionar una mezcla de células MDCK, y (iii) cultivo de la mezcla de células MDCK con el fin de producir un virus.

3. Método de preparación de un virus para la fabricación de vacunas, que comprende las etapas de (i) transfección de un cultivo de células hospedadoras con al menos un constructo de expresión que codifica una molécula de ARN viral, (ii) adición de células a las células hospedadoras transfectadas de (i) para proporcionar una mezcla de células, en el que las células hospedadoras y las células añadidas después de la transfección son de la misma línea celular,

(iii) cultivo de la mezcla de células con el fin de producir un virus, y (iv) purificación del virus obtenido en la etapa (iii) .

4. Método de preparación de un virus para la fabricación de vacunas, que comprende las etapas de (i) transfección de un cultivo de células MDCK con al menos un constructo de expresión que codifica una molécula de ARN viral, (ii) adición de células MDCK a las células MDCK transfectadas de (i) para proporcionar una mezcla de células MDCK;

(iii) cultivo de la mezcla de células MDCK con el fin de producir un virus, y (iv) purificación del virus obtenido en la etapa (iii) .

5. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 3 en el que la célula hospedadora es una célula VERO, PER.C6 o MDCK.

6. Método según la reivindicación 2, la reivindicación 4 o la reivindicación 5 en el que la célula MDCK es la línea celular MDCK 33016 (DSM ACC2219) .

7. Método según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, o la reivindicación 5 o la reivindicación 6 cuando dependen de la reivindicación 3 o de la reivindicación 4, que comprende adicionalmente la etapa de formulación del virus purificado en la etapa (iv) en una vacuna,

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que las células se cultivan en suspensión.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que las células se cultivan mediante cultivo adherente.

10. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el virus es un virus segmentado.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el virus es un virus de ARN de cadena negativa.

12. Método según la reivindicación 11, en el que el virus es un virus de la gripe.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el virus es un virus de ARN bicatenario.

14. Método según la reivindicación 13, en el que el virus es un rotavirus.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la reivindicación 13, en el que el virus es un virus no segmentado.