Métodos de procedimiento de purificación de fucoidano a partir de extractos de algas marinas.

Un procedimiento de purificación de fucoidano de una mezcla heterogénea,

comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar una fuente de fucoidano;

(b) eliminar iones de metales pesados de dicha fuente tratando con un agente quelante para producir una primera mezcla de fucoidano;

(c) precipitar selectivamente el fucoidano presente en dicha primera mezcla de fucoidano para eliminar contaminantes;

(d) resuspender el precipitado que contiene fucoidano en disolución acuosa para producir una segunda mezcla de fucoidano;

(e) repetir las etapas (c) y (d) una o más veces; y

(f) filtrar la disolución acuosa que comprende fucoidano para eliminar contaminantes bacterianos y de endotoxinas para dar fucoidano purificado.

Mïtodos de procedimiento de purificaciïn de fucoidano a partir de extractos de algas marinas

CAMPO TïCNICO

La presente invenciïn se refiere generalmente a la producciïn de fucoidano (tambiïn llamado AV513 en el presente documento) . Mïs particularmente, la invenciïn se refiere a procedimientos de purificaciïn de extracto de fucoidano para eliminar iones de metales pesados, contaminantes bacterianos y de endotoxinas y otras impurezas sin afectar la actividad biolïgica deseada.

ANTECEDENTES

La coagulaciïn normal de la sangre es un proceso fisiolïgico y bioquïmico complejo que estï regulado en varios niveles.

El proceso de la coagulaciïn de la sangre implica la activaciïn de una cascada de factores de coagulaciïn que conduce a la formaciïn de fibrina y a la agregaciïn de plaquetas, junto con vasoconstricciïn local (revisado por Davie y col., Biochemistr y 30:10363, 1991) . La cascada de coagulaciïn estï compuesta por una ruta “extrïnseca” que se cree que es el medio principal del inicio de la coagulaciïn normal y una ruta “intrïnseca” que contribuye a una respuesta de la coagulaciïn ampliada. La respuesta normal a una lesiïn de agresiïn hemorrïgica implica la activaciïn de la ruta extrïnseca. La activaciïn de la ruta extrïnseca se inicia cuando la sangre se pone en contacto con factor tisular (TF) , un cofactor para el factor VII que se expone o expresa en tejidos tras la agresiïn. El TF forma un complejo con FVII que facilita la producciïn de FVIIa. A continuaciïn FVIIa se asocia con TF para convertir FX en la serina proteasa FXa, que es un componente crïtico del complejo de protrombinasa. La conversiïn de protrombina en trombina por el complejo de FXa/FVa/calcio/fosfolïpido estimula la formaciïn de fibrina y la activaciïn de plaquetas, siendo todo esencial para la coagulaciïn normal de la sangre. La hemostasia normal se potencia adicionalmente por los factores IXa y VIIIa de la ruta intrïnseca, que tambiïn convierten FX en FXa. Vïase tambiïn Weitz, J. I. y col., Chest, 126 (3) , septiembre de 2004 (Supl) , 265S.

Los polisacïridos sulfatados son una clase de molïculas caracterizadas por una plïtora de actividades biolïgicas con perfiles de tolerabilidad frecuentemente favorables en animales y seres humanos. Estas molïculas polianiïnicas se derivan frecuentemente de tejidos de plantas y animales y engloban una amplia variedad de subclases que incluyen heparinas, glucosaminoglicanos, fucoidanos, carrageninas, polisulfatos de pentosano y sulfatos de dermatano o dextrano. Los polisacïridos sulfatados similares a heparina presentan actividad anticoagulante diferencial mediada mediante interacciones de antitrombina III y/o cofactor II de heparina (Toida TC, Linhardt, RJ., Trends in Glycoscience and Glycotechnology 2003; 15:29-46) .

Aunque un polisacïrido sulfatado tal, la heparina oral, se ha considerado para el desarrollo como anticoagulante (A Dunn, Idrugs, 3:817-824, 2000) , la heparina es inadecuada debido a sus graves complicaciones que incluyen hemorragias intraoperatorias y postoperatorias, osteoporosis, alopecia, resistencia a heparina, rebote de heparina, trombocitopenia inducida por heparina (TIH) , sïndrome de trombocitopenia-trombosis inducida por heparina (STTIH) y otras desventajas que incluyen mïltiples dïas para atenuar la anticoagulaciïn despuïs de retirar el fïrmaco (Iqbal O y col., Fareed J, Expert Opin Emerg Drugs 6:111-135, 2001; Roberts, HR, Anesthesiology 100:722-730, 2004) . La heparina se administra convencionalmente parenteralmente y posee un nivel de captaciïn oral de solo aproximadamente el 1 % (Fitton, J.H., Glycoscience, The Nutrition Science Site, modificado el 1 de enero de 2005) .

A diferencia de la heparina, se ha mostrado que otro polisacïrido sulfatado, el fucoidano, un polisacïrido sulfatado aislado de una alga marina, regula (es decir, promueve) la coagulaciïn (publicaciïn de patente de EE.UU. n.ï 2005/0282771) . Especïficamente, los fucoidanos, cuando se administran a bajas concentraciones in vitro, o bajas dosis subcutïneas in vivo, proporcionan coagulaciïn mejorada (acelerada) en casos de hemofilia mediante la activaciïn de la ruta extrïnseca (Liu, T. y col. y Johnson, K.W., Thrombosis and Haemostasis, 95:68-76, 2006) , demostrando una actividad pro-coagulante. A mayores dosis el fucoidano puede tener un efecto anticoagulante similar a la heparina. En vista de los problemas asociados a los presentes anticoagulantes como la heparina o la warfarina, sigue existiendo claramente una necesidad de agentes, tales como fucoidano, que puedan vencer uno o mïs de los problemas asociados a la terapia anticoagulante actualmente disponible.

Asï, sigue existiendo la necesidad de un procedimiento mejorado para producir rentable y eficazmente extracto enriquecido en fucoidano con actividad ïptima para uso terapïutico procoagulante o anticoagulante.

SUMARIO DE LA INVENCIïN

La presente invenciïn se basa en el descubrimiento de un procedimiento de purificaciïn de fucoidano a partir de extracto de algas marinas. El procedimiento proporciona altos rendimientos de fucoidano sustancialmente libre de iones de metales pesados, contaminantes bacterianos y de endotoxinas y otras impurezas.

Por consiguiente, la invenciïn objeto incluye un procedimiento de enriquecimiento de fucoidano de una mezcla heterogïnea, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una fuente de fucoidano;

(b) eliminar iones de metales pesados de dicha fuente tratando con un agente quelante para producir una 5 primera mezcla de fucoidano;

(c) precipitar selectivamente el fucoidano presente en dicha primera mezcla de fucoidano para eliminar contaminantes;

(d) resuspender el precipitado que contiene fucoidano en disoluciïn acuosa para producir una segunda mezcla de fucoidano;

(e) repetir las etapas (c) y (d) una o mïs veces; y

(f) filtrar la disoluciïn acuosa que comprende fucoidano para eliminar contaminantes bacterianos y de endotoxinas para dar extracto de fucoidano purificado.

En una realizaciïn, el fucoidano posee del 5 al 25 por ciento en peso de azufre. En otra realizaciïn, el fucoidano es de origen algal. En una realizaciïn preferida, el fucoidano se deriva del gïnero Fucus o Laminaria. Fucoidanos a modo de ejemplo son aquellos derivados de Fucus vesiculosis o de Laminaria japonica u otras fuentes que incluyen, pero no se limitan a, Undaria pinnitifada y Ascophyllum nodosum.

En ciertas realizaciones, el agente quelante estï seleccionado del grupo que consiste en ïcido etilendiaminatetraacïtico (EDTA) , acïtico etilenglicol-bis- (beta-aminoetilïter) -N, N, N', N'-tetraïcido (EGTA) , ïcido 2, 3-dimercaptopropanol-1

sulfïnico (DMPS) y ïcido 2, 3-dimercaptosuccïnico (DMSA) . En una realizaciïn preferida, el agente quelante es EDTA. En ciertas realizaciones, el agente quelante se inmoviliza sobre un soporte sïlido. En una realizaciïn, el agente quelante es una resina quelante de iminodiacetato.

En ciertas realizaciones, el fucoidano se precipita selectivamente una o mïs veces con etanol, en las que la concentraciïn de etanol en la mezcla de fucoidano es de aproximadamente el 40 % al 50 % (v/v) . En ciertas realizaciones, el pH se mantiene entre aproximadamente pH 5, 7 y aproximadamente pH 6, 0. En una realizaciïn preferida, el pH se ajusta a aproximadamente pH 5, 95. En ciertas realizaciones se aïade NaCl a la mezcla de fucoidano a una concentraciïn de aproximadamente 20-24 g/litro.

En otro aspecto, la memoria descriptiva proporciona una composiciïn que comprende fucoidano producido por cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. En una realizaciïn, el fucoidano posee del 5 al 25 por ciento en peso de azufre. En otra realizaciïn, el fucoidano es de origen algal. En una realizaciïn preferida, el fucoidano se deriva del gïnero Fucus o Laminaria. Fucoidanos a modo de ejemplo son aquellos derivados de Fucus vesiculosis o de Laminaria japonica o de Chorda filum, Cladosiphon okamuranus, Undaria pinnatifida, Leathesia difformis, Ascophyllum nodosum, Ecklonia kurome, Pelvetia fastigiata, Saundersella simplex, Chordaria flagelliformis, o cualquier otra especie de planta o animal marino que contenga fucoidano. En una realizaciïn preferida, el fucoidano es biolïgicamente activo, por ejemplo, teniendo actividad pro-coagulante. En ciertas realizaciones, la composiciïn puede comprender ademïs un excipiente farmacïuticamente aceptable.

En otro aspecto, la memoria descriptiva proporciona un procedimiento para tratar un sujeto en necesidad de coagulaciïn de la sangre potenciada que comprende administrar una cantidad terapïuticamente eficaz de una composiciïn que comprende fucoidano,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de purificaciïn de fucoidano de una mezcla heterogïnea, comprendiendo el procedimiento: 5 (a) proporcionar una fuente de fucoidano;

(b) eliminar iones de metales pesados de dicha fuente tratando con un agente quelante para producir una primera mezcla de fucoidano;

(c) precipitar selectivamente el fucoidano presente en dicha primera mezcla de fucoidano para eliminar contaminantes;

(d) resuspender el precipitado que contiene fucoidano en disoluciïn acuosa para producir una segunda mezcla de fucoidano;

(e) repetir las etapas (c) y (d) una o mïs veces; y

(f) filtrar la disoluciïn acuosa que comprende fucoidano para eliminar contaminantes bacterianos y de endotoxinas para dar fucoidano purificado.

2. El procedimiento de la reivindicaciïn 1, en el que el fucoidano posee del 5 al 25 por ciento en peso de azufre.

3. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el fucoidano es de origen algal.

4. El procedimiento de la reivindicaciïn 3, en el que el fucoidano es del gïnero Fucus o Laminaria. 25

5. El procedimiento de la reivindicaciïn 4, en el que el fucoidano es de Fucus vesiculosis o Laminaria japonica.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el agente quelante estï seleccionado del

grupo que consiste en ïcido etilendiaminatetraacïtico (EDTA) , ïcido etilenglicol-bis- (beta-aminoetilïter) -N, N, N', N'30 tetraacïtico (EGTA) , ïcido 2, 3-dimercaptopropanol-1-sulfïnico (DMPS) y ïcido 2, 3-dimercaptosuccïnico (DMSA) .

7. El procedimiento de la reivindicaciïn 6, en el que el agente quelante es EDTA.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el agente quelante se inmoviliza sobre un 35 soporte sïlido.

9. El procedimiento de la reivindicaciïn 8, en el que el agente quelante es una resina quelante de iminodiacetato.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el fucoidano en dicha primera mezcla de 40 fucoidano se precipita selectivamente con etanol.

11. El procedimiento de la reivindicaciïn 10, en el que la concentraciïn de etanol es aproximadamente del 40 % al 50 % (v/v) .

12. El procedimiento de la reivindicaciïn 10, en el que el pH se mantiene entre aproximadamente pH 5, 7 y aproximadamente pH 6, 0.

13. El procedimiento de la reivindicaciïn 12, en el que el pH se ajusta a aproximadamente pH 5, 95.

14. El procedimiento de la reivindicaciïn 10, en el que se aïade NaCl a la mezcla de fucoidano a una concentraciïn de aproximadament.

2. 24 g/litro.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que comprende repetir las etapas (c) y (d) tres veces. 55

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, que comprende ademïs liofilizaciïn del fucoidano purificado.

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