Métodos de detección de interacciones cromosómicas de largo alcance.

Un método de control de los cambios epigenéticos en las interacciones cromosómicas condicionales de largo alcance en al menos un locus cromosómico donde las diferentes conformaciones de las interacciones de largo alcance están asociadas con una condición asociada con un cambio en el nivel de expresión de uno o más genes o un cambio

en uno o más productos génicos en donde la condición se selecciona de entre cáncer,

trastornos cardiovasculares, condiciones inflamatorias, incluyendo trastornos autoinmunes y respuestas inflamatorias a enfermedades infecciosas y trastornos genéticos heredados modulados por mecanismos epigenéticos, comprendiendo dicho método las etapas de:

(i) entrecruzamiento in vitro de dichas interacciones cromosómicas de largo alcance presentes en al menos un locus cromosómico;

(ii) aislamiento el ADN entrecruzado de dicho locus cromosómico;

(iii) sometimiento de dicho ADN entrecruzado a una digestión de restricción con una enzima que corta al menos una vez dentro de al menos un locus cromosómico;

(iv) ligar dichos extremos del ADN escindido entrecruzado para formar bucles de ADN;

(v) la identificación de la presencia de bucles de ADN;

en donde la presencia de bucles de ADN indica la presencia de una interacción cromosómica específica de largo alcance y en donde las interacciones cromosómicas de largo alcance no son interacciones de largo alcance entre genes y sus elementos reguladores.

Métodos de detección de interacciones cromosómicas de largo alcance Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para controlar los cambios epigenéticos.

Antecedentes

El genoma eucariota está organizado en estructuras complejas de orden superior; de hecho, las primeras micrografías electrónicas de la cromatina extraída revelaron una estructura sin histona que forma bucles radiales (Eamshaw y Laemmli, 1983, J Cell Bio 96, 84-93). El superenrollamiento negativo sin restricciones en los genomas de mamíferos sugiere tamaños de "dominio" del cromosoma del orden de decenas de kilobases (Kramer y Sinden, 1997, Biochem 36, 3151-3158). Más recientemente, el uso de la tecnología 3C (captura de la conformación del cromosoma) se ha demostrado que existen interacciones de largo alcance de orden superior en una amplia variedad de eucariotas, incluyendo células de S. cerevisiae (Dekker et al., 22, Science 295, 136-1311), mosca (Blanton et al., 23 Genes Dev 17, 664-675), ratón (Tolhuis et al., 22, Mol Cell 1, 1453-1465) y humano (Carroll et al., 25, Cell 122, 33-43), generalmente de un tamaño de kilobases. En células de mamíferos, se ha demostrado la asociación de regiones de control del locus o reforzadoras con los genes expresados de forma activa en los loci de (S-globina (Tolhuis et al., 22, Mol Cell 1, 1453-1465) y de la proteína C reactiva (Choi et al., 27, Nucleic Acids Res. 35, 5511-5519), así como la formación de bucles reunidos de genes recombinantes de inmunoglobulina (Skok et al., 27, Nat Immunol 8, 378-387). En células de mamíferos, se propone una transcripción continua para dirigir la organización del genoma y la formación de bucles de genes (Chakalova et al., 25 Nat Rev Genet 6, 669-677; Marenduzzo et al., 27, Trends Genet 23, 126-133 y las referencias allí), pero análisis recientes sugieren que, al menos para el locus de (3-globina, se mantienen algunas interacciones de ADN de largo alcance después de inhibir la transcripción (Palstra et al., 28 PLoS ONE 3, e1661) argumentando en contra de los modelos que sugieren que las funciones comprometidas de la ARN polimerasa como las ataduras de los bucles de cromatina.

En el genoma de levadura, la transcripción activa parece ser importante para la formación de "bucles de genes", interacciones de largo alcance que enlazan las regiones 5' y 3' de los genes activos (Ansari y Hampsey, 25 Genes Dev 19, 2969-2978, O'Sullivan et al, 24, Nat Genet 36, 114-118; Singh y Hampsey, 27, Mol Cell 27, 86-816). La inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) demuestra la presencia de TFIIB y la forma fosforilada de RNAPII en ambos promotores y terminadores. Además, se requiere de TFIIB funcional para formar estas interacciones de largo alcance (Singh y Hampsey, 27, Mol Cell 27, 86-816). TFIIB es capaz de interactuar con el ARN no codificante y la pérdida de TFIIB promovida por el ARN no codificante conduce a la pérdida de la interacción de largo alcance en DFHR (Martianov et al, 27, Nature 445, 666-67).

Los altos niveles de ARN no codificante transcritos en todo el genoma incluyen transcriptos antisentido para marcos de lectura abiertos. Existen tanto en genomas eucariotas como procariotas (Johnson et al, 25, Trends Genet 21, 93-12, Kapranov et al, 27, Nat Rev Genet 8, 413-423; Selingery otros, 2, Proc Nati Acad Sci EE.UU. 13 , 4.192-4197). En eucariotas, muchos de estos transcriptos no están destinados nunca para su traducción en proteína y algunos están destinados para degradación mediada por el exosoma por parte del complejo TRAMP (Bickel y Morris, 26 Cell Mol 22, 39-316). En la levadura estos transcriptos inestables crípticos (los CUT) se detectan en promotores (Berretta et al, 28, Genes Dev 22, 615-626; Davis y Ares, 26, Proc Nati Acad Sci EE.UU. 13, 3262-3267), en las regiones entre los genes (Wyers et al, 25, Cell 121, 725-737) y antisentido de genes (Camblong et al, 27 Cell 131, 76-717; Uhler et al, 27, Proc Nati Acad Sci EE.UU. 14, 811-816).

Experimentos detallados que perfilan los ARN de S. cerevisiae utilizando microchips han demostrado que la transcripción se produce en casi todas partes del genoma de la levadura (Perocchi et al, 27, Nucleic Acids Res 35, e128; Samanta et al, 26, Proc Nati Acad Sci EE.UU. 13, 4192-4197; Miura et al y otros, 26, PNAS 13, 17846-17851; Hongay et al, 26, Cell 127, 735-745; David y otros, 26, Proc Nati Acad Sci EE.UU. 13, 532-5325; Havilio et al, 25, BMC Genomics 6, 93). Estos análisis también indican que se transcriben al menos parcialmente entre 1 y 37 genes en ambas direcciones que producen transcriptos sentido y antisentido poliadenilados estables. Muchos de estos genes se transcriben activamente.

Los presentes inventores han utilizado el locus GAL como un sistema modelo en el cual comparar los estados inducidos y reprimidos y observar diferencias en el transcripto antisentido y la regulación epigenética. Los inventores muestran que hay transcriptos antisentido que controlan tanto los estados inducidos como los reprimidos en el locus GAL, y que estos transcriptos difieren en tamaño, posición y abundancia. Transcriptos antisentido muy abundantes en el locus inducido están asociados con la producción del transcripto sentido a partir del promotor GALIO. Además, los niveles de transcriptos antisentido se correlacionan fuertemente con los niveles de Hda1 asociados con el locus pero no con la acetilación misma

de las historias. Los inventores también identifican que Hda1 parece ser necesario para las interacciones de largo alcance en el locus GAL reprimido, lo que sugiere un vínculo entre los transcriptos antisentido, las modificaciones epigenéticas y las estructuras de cromatina de orden superior en el estado reprimido. Los cambios en la conformación del locus después de la conmutación del estado reprimido al estado inducido han sido identificados con implicación del ARN antisentido en el control de este. La presente invención se basa en el descubrimiento de que la represión de genes es un estado proactivo de la regulación que implica cambios epigenéticos específicos del locus.

Resumen

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para controlar los cambios epigenéticos que comprenden el seguimiento de los cambios en las interacciones cromosómicas condicionales de largo alcance en al menos un locus cromosómico donde diferentes conformaciones de interacciones de largo alcance están asociadas con una condición asociada con un cambio en el nivel de expresión de uno o más genes o un cambio en uno o más productos génicos en donde la condición se selecciona entre cáncer, trastornos cardiovasculares, condiciones inflamatorias, incluyendo trastornos autoinmunes y respuestas inflamatorias a enfermedades inflamatorias y trastornos genéticos heredados modulados por mecanismos epigenéticos dicho método comprendiendo las etapas de:

(i) entrecruzamiento in vitro de dichas interacciones cromosómicas de largo alcance presentes en al menos un locus cromosómico;

(ii) aislamiento el ADN entrecruzado de dicho locus cromosómico;

(iii) sometimiento de dicho ADN entrecruzado a una digestión de restricción con una enzima que corta al menos una vez dentro de al menos un locus cromosómico;

(iv) ligar dichos extremos del ADN escindido entrecruzado para formar bucles de ADN;

(v) la identificación de la presencia de bucles de ADN;

en donde la presencia de bucles de ADN indica la presencia de una interacción cromosómica específica de largo alcance y en donde las interacciones cromosómicas de largo alcance no son interacciones de largo alcance entre genes y sus elementos reguladores.

Se entenderá que las interacciones cromosómicas condicionales de largo alcance siempre estarán presentes en la cromatina. Se entenderá además que estas interacciones son dinámicas y cambiarán dependiendo del estado de la región del cromosoma, es decir, si se está transcribiendo o reprimiendo en respuesta al cambio de las condiciones fisiológicas.

Tal como se utiliza aquí, el término interacciones condicionales de largo alcance se refiere a las interacciones entre las regiones distales de un locus en un cromosoma, siendo dichas interacciones dinámicas y que producen alteración dependiendo del estado de la región del cromosoma.

Como se usa en este documento, el término espectro de interacción de largo alcance se refiere a las diferentes conformaciones de las interacciones cromosómicas de largo alcance que pueden estar presentes en un locus cromosómico dado. Se entenderá que como se describió anteriormente, estas interacciones son dinámicas, con diversas interacciones de conformación o de rompimiento de largo alcance dependiendo del estado del locus.

Se entenderá además que las interacciones... [Seguir leyendo]

1. Un método de control de los cambios epigenéticos en las Interacciones cromosómicas condicionales de largo alcance en al menos un locus cromosómlco donde las diferentes conformaciones de las interacciones de largo alcance están asociadas con una condición asociada con un cambio en el nivel de expresión de uno o más genes o un cambio en uno o más productos génicos en donde la condición se selecciona de entre cáncer, trastornos cardiovasculares, condiciones inflamatorias, incluyendo trastornos autoinmunes y respuestas inflamatorias a enfermedades infecciosas y trastornos genéticos heredados modulados por mecanismos epigenéticos, comprendiendo dicho método las etapas de:

(i) entrecruzamlento in vitro de dichas interacciones cromosómicas de largo alcance presentes en al menos un locus cromosómlco;

(¡i) aislamiento el ADN entrecruzado de dicho locus cromosómico;

(¡II) sometimiento de dicho ADN entrecruzado a una digestión de restricción con una enzima que corta al menos una vez dentro de al menos un locus cromosómico;

(iv) ligar dichos extremos del ADN escindido entrecruzado para formar bucles de ADN;

(v) la Identificación de la presencia de bucles de ADN;

en donde la presencia de bucles de ADN indica la presencia de una interacción cromosómica específica de largo alcance y en donde las interacciones cromosómicas de largo alcance no son interacciones de largo alcance entre genes y sus elementos reguladores.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la presencia de los bucles de ADN se identifican utilizando técnicas de PCR.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la presencia de un bucle de ADN Indica un estado de transcripción alterado indicativo de una condición fisiológica específica.