Método para recolectar células troncales placentarias.

Un método para aislar células troncales a partir de una placenta de mamífero aislada y exsanguinada,

en el que dichas células troncales son células troncales CD34+ o células troncales similares a MSC adherentes a plástico para cultivo de tejidos fibroblastoides, comprendiendo dicho método:

perfusionar dicha placenta con una disolución de perfusión, haciendo pasar dicha disolución de perfusión hacia la arteria umbilical o la vena umbilical, o ambas, de dicha placenta, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para aislar una cantidad detectable de células troncales a partir de dicha placenta, habiendo sido dicha placenta drenada de sangre de cordón umbilical y sangre materna antes de dicha perfusión; y aislar dichas células troncales y la disolución de perfusión de dicha placenta;

en el que, para dichas células troncales similares a MSC adherentes a plástico para cultivo de tejidos, el método comprende además aislar dichas células troncales mediante técnicas de adhesión diferencial;

en el que dichas células troncales similares a MSC pueden obtenerse mediante una técnica de adhesión diferencial que comprende una tripsinización diferencial empleando tripsina al 0,05% con EDTA al 0,2%.

Método para recolectar células troncales placentarlas Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente Invención pertenece, en general, al área de la recolección de células troncales y, en particular, a la recuperación de células troncales CD34+ o células troncales similares a MSC adherentes a plástico para cultivo de tejidos fibroblastoides procedentes de placentas. Estas células troncales se obtienen de placenta recogida después del nacimiento. Estas células troncales tienen características de células troncales embrionarias pero no se derivan del embrión.

2. Descripción de la técnica anterior

Las células troncales humanas son células precursoras totipotenciales o plurlpotenclales capaces de generar una diversidad de linajes de células humanas maduras. Esta capacidad sirve como base para la diferenciación celular y la especlallzaclón necesaria para el desarrollo de órganos y tejidos. Los éxitos recientes en el transplante de dichas células troncales han proporcionado nuevas herramientas clínicas para reconstituir y/o complementar la médula ósea después de una mleloablaclón debido a enfermedad, exposición a químicos tóxicos o radiación. Existen más pruebas que demuestran que las células troncales pueden emplearse para repoblar muchos, o todos, los tejidos y restablecer la funcionalidad fisiológica y anatómica. La aplicación de células troncales en la ingeniería de tejidos, la administración de terapias génicas y la terapéutica celular también está avanzando con rapidez.

La obtención de suficientes células troncales humanas ha resultado problemático por varias razones. En primer lugar, el aislamiento de poblaciones naturales de células troncales en tejidos adultos ha resultado difícil desde el punto de vista técnico, es caro y muy limitado en cuanto a cantidad. En segundo lugar, la obtención de estas células a partir de embriones o tejido fetal, que incluye abortos, ha generado muchos problemas éticos y morales. La creencia muy extendida de que el embrión y el feto humano constituyen vida independiente ha justificado una moratoria sobre el uso de dichas fuentes para cualquier fin. Otras fuentes alternativas que no vulneren la inviolabilidad de la vida independiente serian fundamentales para un mayor avance en el uso de células troncales desde un punto de vista clínico.

La sangre de cordón umbilical (sangre de cordón umbilical) es una fuente conocida de células troncales progenitoras pluripotentes hemopoyéticas, que son crioconservadas para su uso en la reconstitución hemopoyética. La utilización de sangre de cordón umbilical para este fin es muy conocido y se está convirtiendo en un procedimiento terapéutico de amplio uso. La técnica convencional para la recolección de sangre de cordón umbilical se basa en el uso de una aguja o cánula que se emplea con la ayuda de la gravedad para drenar la sangre de cordón umbilical de la placenta. Habitualmente, la aguja o la cánula se coloca en la vena umbilical y la placenta se masajea con suavidad para ayudar a drenar la sangre de cordón umbilical de la placenta. Después, la placenta drenada se considera sin uso y generalmente se desecha. Una importante limitación en la obtención de células troncales a partir de sangre de cordón umbilical ha sido el volumen, con frecuencia inadecuado, de sangre de cordón umbilical obtenido, que resulta en un número insuficiente de células para reconstituir la médula ósea después de un transplante.

El suministro de células troncales se encuentra en unos niveles críticos. Estas son importantes para el tratamiento de una amplia variedad de trastornos, que incluyen malignidades, errores congénitos del metabolismo, hemoglobinopatías e inmunodeficiencias. Sería muy ventajoso contar con una fuente de más células troncales embrionarias.

Por consiguiente, un objeto principal de la presente invención consiste en proporcionar un método para extraer y recuperar células troncales hematopoyéticas a partir de una placenta exsanguinada.

Un objeto de la presente descripción consiste también en proporcionar un método para aislar otras células troncales omnipotentes y/o similares a células embrionarias a partir de un extractante de una placenta drenada.

Otro objeto de la presente descripción consiste en proporcionar un método para recolectar células troncales a partir de la vena del cordón umbilical, la mejor fuente de células troncales progenitoras pluripotentes hemopoyéticas.

Otro objeto de la presente descripción consiste en proporcionar un método y un medio mediante el cual pueden obtenerse más células troncales similares a células embrionarias en concentraciones mayores a partir de una placenta drenada.

Otro objeto de la presente descripción consiste en proporcionar un método para utilizar la placenta aislada y perfusionada como biorreactor para proporcionar un buen entorno para la propagación de células endógenas, que incluyen, pero no se limitan a linfocitos y células troncales.

Otro objeto de la presente descripción consiste en proporcionar un método y un medio mediante el cual pueden obtenerse células troncales muchas horas después del nacimiento y la expulsión de la placenta del útero.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método para aislar células troncales a partir de una placenta de mamífero aislada y exsanguinada, en el que dichas células troncales son células troncales CD34+ o células troncales similares a MSC adherentes a plástico para cultivo de tejidos fibroblastoides, comprendiendo dicho método perfusionar dicha placenta con una disolución de perfusión, haciendo pasar dicha disolución de perfusión hacia la arteria umbilical o la vena umbilical, o ambas, de dicha placenta, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para aislar una cantidad detectable de células troncales a partir de dicha placenta, habiendo sido dicha placenta drenada de sangre de cordón umbilical y sangre materna antes de dicha perfusión; y aislar dichas células troncales y la disolución de perfusión de dicha placenta, en el que, para dichas células troncales similares a MSC adherentes a plástico para cultivo de tejidos, el método comprende además aislar dichas células troncales mediante una técnica de adhesión diferencial, en el que dichas células troncales similares a MSC pueden obtenerse mediante una técnica de adhesión diferencial que comprende una tripsinización diferencial empleando tripsina al ,5% con EDTA al ,2%.

Se ha desarrollado un método para extraer células troncales similares a células embrionarias a partir de una placenta drenada mediante una técnica de perfusión que utiliza la arteria umbilical o la vena umbilical, o ambas, en la recuperación de placenta humana después de la exsanguinación y la recolección de la sangre residual. La placenta después se procesa de tal manera que se establece un entorno de biorreactor natural ex vivo en el que las células troncales residentes dentro del parénquina y el espacio extravascular se reclutan y migran hacia la microcirculación vacía, en donde pueden ser lavadas hacia un recipiente de recolección mediante perfusión.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una vista en corte transversal de la canulación de la vena y la arteria de una placenta para perfusionar la placenta y después recolectar el perfusionado.

Las figuras 2a-e son dibujos esquemáticos que muestran la recolección, el pinzamiento, la perfusión, la recolección y la conservación de una placenta drenada y perfusionada.

La figura 3 es un esquema en corte transversal de una placenta perfusionada en un dispositivo para su uso como biorreactor.

La figura 4 es un esquema de la selección para clasificar las células extraídas de una placenta perfusionada. Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un método para aislar células troncales a partir de una placenta de mamífero aislada y exsanguinada, en el que dichas células troncales son células troncales CD34+ o células troncales similares a MSC adherentes a plástico para cultivo de tejidos fibroblastoides, comprendiendo dicho método perfusionar dicha placenta con una disolución de perfusión, haciendo pasar dicha disolución de perfusión hacia la arteria umbilical o la vena umbilical, o ambas, de dicha placenta, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para aislar una cantidad detectable de células troncales a partir de dicha placenta, habiendo sido dicha placenta drenada de sangre de cordón umbilical y sangre materna antes de dicha perfusión; y aislar dichas células troncales y la disolución de perfusión de dicha placenta, en el que, para dichas células troncales similares... [Seguir leyendo]

1Un método para aislar células troncales a partir de una placenta de mamífero aislada y exsangulnada, en el que dichas células troncales son células troncales CD34+ o células troncales similares a MSC adherentes a plástico para cultivo de tejidos fibroblastoldes, comprendiendo dicho método:

perfuslonar dicha placenta con una disolución de perfusión, haciendo pasar dicha disolución de perfusión hacia la arteria umbilical o la vena umbilical, o ambas, de dicha placenta, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para aislar una cantidad detectable de células troncales a partir de dicha placenta, habiendo sido dicha placenta drenada de sangre de cordón umbilical y sangre materna antes de dicha perfusión; y aislar dichas células troncales y la disolución de perfusión de dicha placenta;

en el que, para dichas células troncales similares a MSC adherentes a plástico para cultivo de tejidos, el método comprende además aislar dichas células troncales mediante técnicas de adhesión diferencial;

en el que dichas células troncales similares a MSC pueden obtenerse mediante una técnica de adhesión diferencial que comprende una tripsinización diferencial empleando tripsina al ,5% con EDTA al ,2%.

2.- El método de la reivindicación 1, en el que dicha placenta se perfusiona periódicamente a las 4, 8, 12 y 24 horas.

3.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la placenta se mantiene a temperatura ambiente durante 2 a 24 horas después de la canulación y después se perfusiona periódicamente.

4.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha perfusión se realiza utilizando un primer volumen de entre aproximadamente 3 mi y aproximadamente 15 mi de dicha disolución de perfusión.

5.- El método de la reivindicación 4, que comprende además continuar dicha perfusión utilizando un segundo volumen de aproximadamente 3 mi a aproximadamente 15 mi de dicha disolución de perfusión, aislándose dicho segundo volumen por separado de dicho primer volumen.

6.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha perfusión se realiza una pluralidad de veces.

7 - El método de la reivindicación 6, en el que, para cada una de dichas veces, dicha perfusión se realiza utilizando un volumen de aproximadamente 3 mi a aproximadamente 15 mi de dicha disolución de perfusión.

8 - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además separar dichas células troncales placentarias de dicha disolución de perfusión.

9 - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha separación se realiza mediante centrifugación.

- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dichas células troncales placentarias se aislan a lo largo de un perido de hasta 48 horas.

11- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1, en el que dicha disolución de perfusión comprende un anticoagulante.

12 - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha disolución de perfusión comprende heparina, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o creatina fosfato dextrosa (CPDA).

13 - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha disolución de perfusión comprende eritropoyetina.

14.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicha placenta de mamífero aislada es una placenta de postparto que queda después de un nacimiento con éxito.