Método para producir moléculas de unión al receptor OX40 humano.

Un método para producir una molécula de unión aislada que se une a OX40R humano,

y el método comprende expresar una secuencia de aminoácidos de la molécula de unión en una célula hospedadora que comprende uno o más vectores de expresión que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican la secuencia de aminoácidos de la molécula de unión, en el que la molécula de unión comprende:

A. (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3;

(d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 4;

(e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 5; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6; o

B. (a) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 7; y

(b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8; o

C. (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 13;

(b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 14;

(c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 15;

(d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 16;

(e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 17; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 18; o

D. (a) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 19; y

(b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 20.

Método para producir moléculas de unión al receptor OX40 humano Antecedentes La presente descripción se refiere a anticuerpos, y en particular a anticuerpos que se unen al receptor OX40.

La estimulación de la función de las células T anti-tumorales representa una aproximación potente y nueva para el tratamiento del cáncer. Los componentes cruciales implicados en la generación de una respuesta eficaz de células T anti-tumorales incluyen la estimulación de la actividad de las células T auxiliares CD4+ para favorecer la generación de células T citolíticas anti-tumorales, y proporcionar señales de supervivencia para las células T efectoras y de memoria. Un receptor clave que se ha demostrado que actúa como mediador en estas respuestas es el receptor OX40. Sugamura, K., Ishii, N., Weinberg, A. Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulator y molecule OX40. Nature Rev. Imm. 4: 420-431 (2004) ; Hori, T. Roles of OX40 in the pathogenesis and control of diseases. Intn.

J. Hematology. 83: 17-22 (2006) .

El receptor OX40 (OX40R) (también conocido como CD134, TNFRSF4, ACT-4, ACT35, y TXGP1L) es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF. Se ha descubierto que el OX40R se expresa en las células T CD4+ activadas. Se ha demostrado que hay un número elevado de células T OX40R+ en tumores (linfocitos infiltrantes de tumores) y en los nódulos linfáticos de drenaje de pacientes de cáncer (Vetto, J.T. et al. 1997. Presence of the T-cell activation marker OX-40 on tumor infiltrating lymphocytes and draining lymph nodes cells from patients with melanoma and head and neck cancers. Am. J. Surg. 174: 258-265; Weinberg, A. D. et al. Engagement of the OX-40 receptor in vivo enhances antitumor immunity. J. Immunol. 164: 2160-69 (2000) ; Petty, J.K., et al. Survival in human colorectal cancer correlates with expression of the T-cell costimulator y molecule OX-40 (CD134) . Am. J. Surg. 183: 512-518 (2002) ) . Se demostró en los modelos de tumores en ratones que la activación del OX40R in vivo durante la sensibilización de los tumores retrasó y previno significativamente la aparición de los tumores en comparación con los ratones tratados con el control (Weinberg et al., 2000) . Por lo tanto, se ha considerado estimular la respuesta inmunitaria de un mamífero hacia un antígeno activando el OX40R por medio del uso de un agente de unión a OX40R (documento WO 99/42585; Weinberg et al., 2000) .

Sumario La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. La presente descripción proporciona moléculas de unión aisladas que se unen al OX40R humano, que incluyen anticuerpos hacia OX40R, fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos hacia OX40R, y derivados de los anticuerpos hacia OX40R. En ciertas realizaciones, la molécula de unión se une al OX40R humano con una KD de 1 x 10-7 M o menos, y tiene actividad agonista sobre el OX40R humano. En ciertas realizaciones adicionales, la molécula de unión es un anticuerpo monoclonal humano que se une de manera específica al OX40R humano con una KD de 100 nM o menos.

La presente descripción también proporciona una composición que comprende una o más de las moléculas de unión y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la molécula de unión es un anticuerpo monoclonal hacia OX40R humano o un fragmento de unión al antígeno del mismo. La composición puede comprender además agentes farmacéuticos adicionales, tales como agentes quimioterapéuticos, agentes inmunoterapéuticos, y agentes terapéuticos hormonales.

La presente descripción proporciona además métodos terapéuticos y de diagnóstico mediante el uso de las moléculas de unión. En ciertas realizaciones, la descripción proporciona un método para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de unión o una composición que comprende una molécula de unión. En algunas otras realizaciones, la descripción proporciona un método para estimular una respuesta inmunitaria en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de unión o una composición que comprende una molécula de unión. En ciertas realizaciones particulares, la molécula de unión usada en los métodos es un anticuerpo monoclonal hacia OX40R humano o un fragmento de unión al antígeno del mismo.

La presente descripción proporciona además moléculas de ácido nucleico que codifican una secuencia de aminoácidos de una molécula de unión, vectores que comprenden tales ácidos nucleicos, células hospedadoras que comprenden los vectores, y métodos para preparar las moléculas de unión.

La descripción también proporciona otros aspectos, que serán evidentes a partir de la descripción completa, lo que incluye las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos Las Figuras 1a y 1b son gráficos que muestran que el anticuerpo 11D4 se une de manera específica al OX40R;

La Figura 2 es un gráfico que muestra el efecto del anticuerpo entrecruzado 11D4 sobre la actividad de luciferasa estimulada por OX40R;

La Figura 3 es un gráfico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre la producción de IL-2 por células T sensibilizadas con aloantígeno;

La Figura 4 es un gráfico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre la producción de IL-2 inducida por anti-CD3 por células T primarias;

La Figura 5 es un gráfico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre la producción de IL-2 inducida por anti-CD3 por células T primarias de cynomolgus;

La Figura 6 muestra las curvas de unión de saturación con anticuerpo 11D4 mediante el uso de PBMCs de cynomolgus de 14 donantes estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28;

La Figura 7 muestra las curvas de unión de saturación con anticuerpo 11D4 mediante el uso de PBMCs humanas de 17 donantes estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28;

La Figura 8 es un gráfico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del linfoma de células B Raji en ratones SCID;

La Figura 9 es un gráfico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del linfoma de células B Raji 21 días tras la inyección del tumor;

La Figura 10 es un gráfico que muestra el efecto de una única inyección de anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del tumor de próstata PC-3 en ratones SCID;

La Figura 11 es un gráfico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del tumor de próstata PC3 en ratones SCID 27 días tras la inyección del tumor;

La Figura 12 es un gráfico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del carcinoma de colon LOVO en ratones SCID;

La Figura 13 es un gráfico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del carcinoma de colon LOVO en ratones SCID 25 días tras la inyección del tumor;

La Figura 14 es un gráfico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del tumor de mama BT474 en ratones SCID; y

La Figura 15 es un gráfico que muestra el efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del tumor de mama BT474 en ratones SCID.

Descripción detallada Definiciones El término "agonista" se refiere a una molécula de unión, como se define en la presente memoria, que tras la unión al OX40R, (1) estimula o activa el OX40R, (2) estimula, incrementa, favorece, induce, o prolonga una actividad, función, o presencia del OX40R, o (3) estimula, incrementa, favorece, o induce la expresión del OX40R.

El término "anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina que está compuesta en general de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, y cada par tiene una cadena "ligera" (L) y una cadena "pesada" (H) . Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. En las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de alrededor de 12 o más aminoácidos, y la cadena pesada también incluye una región "D" de alrededor de 3 o más aminoácidos. Cada cadena pesada está compuesta de una región variable de la cadena pesada (abreviada en la presente memoria como HCVR o VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de una región variable de la cadena ligera (abreviada en la presente memoria como LCVR o VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. Las... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una molécula de unión aislada que se une a OX40R humano, y el método comprende expresar una secuencia de aminoácidos de la molécula de unión en una célula hospedadora que comprende uno o más vectores de expresión que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican la secuencia de aminoácidos de la molécula de unión, en el que la molécula de unión comprende:

A. (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 1;

(b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 2;

(c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 3;

(d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 4; 10 (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 5; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 6; o

B. (a) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 7; y

(b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 8; 15 o

C. (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 13;

(b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 14;

(c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 15;

(d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 16; 20 (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 17; y

(f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 18; o

D. (a) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 19; y

(b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 25 20.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la molécula de unión: (a) se une al OX40R humano con una KD de 1 x 10-6 M o menos; y (b) tiene actividad agonista sobre el OX40R humano.

3. El método según la reivindicación 1, en el que la molécula de unión es un anticuerpo humano.

4. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la molécula de unión es un anticuerpo quimérico o 30 humanizado.

5. El método según la reivindicación 3, en el que el anticuerpo se une a OX40R humano con una KD de 100 nM o menos.

6. Un método para producir un anticuerpo monoclonal aislado que se une a OX40R humano, y el método

comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un vector de expresión que comprende ADN que 35 codifica el anticuerpo monoclonal, en el que el anticuerpo monoclonal comprende:

(i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 10; o que comprende

(ii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 21 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 22.

Actividad de luciferasa

Efecto del anticuerpo entrecruzado 11D4 sobre la actividad de luciferasa estimulada por OX40R

Concentración de 11D4 (μg/ml)

El anticuerpo 11D4 aumenta la producción de IL-2 por las células T sensibilizadas con aloantígeno Concentración de 11D4 (μg/ml)

Figura 4.

El anticuerpo 11D4 aumenta la producción de IL-2

inducida por anti-CD3 por las células T primarias Concentración de 11D4 (μg/ml)

Figura 5.

Efecto del anticuerpo 11D4 sobre la producción de IL-2 inducida por anti-CD3 por las células T primarias de Cynomolgus Concentración de 11D4 (μg/ml)

Figura 6.

Curvas de unión de saturación con anticuerpo 11D4 mediante el uso de PBMCs de Cynomolgus de 14 donantes estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28

med=0, 354 +/-0, 33 μg/mL

Monos individuales Figura 7.

Curvas de unión de saturación con anticuerpo 11D4 mediante el uso de PBMCs humanas de 17 donantes estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28

med=0, 566 +/-1, 0 μg/mL

Donantes individuales

Figura 8.

Efecto de 11D4 sobre el crecimiento del linfoma de células B Raji en los ratones SCID

Tamaño del tumor (mm2)

Ab de control 10 mg/kg 1 mg/kg 0, 1 mg/kg

Días tras la inyección del tumor

Figura 9.

Efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del linfoma de células B Raji 21 días tras la inyección del tumor

Tamaño del tumor (mm2)

Ab de control

Figura 10.

Efecto de una única inyección de anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del tumor de próstata PC-3 en ratones SCID

Tamaño del tumor (mm2)

Ab de control 10 mg/kg 1 mg/kg 0, 1 mg/kg

Días tras la inyección del tumor

Figura 11.

Efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del tumor de próstata PC-3 en ratones SCID 27 días tras la inyección del tumor

Tamaño del tumor (mm2)

Ab de control

Figura 12.

Efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del carcinoma de colon LOVO en ratones SCID

Ab de control

Tamaño del tumor (mm2)

mg/kg 1 mg/kg 0, 1 mg/kg

Días tras la inyección del tumor

Figura 13.

Efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del carcinoma de colon LOVO en ratones SCID 25 días tras la inyección del tumor

Tamaño del tumor (mm2)

Ab de control

Figura 14.

Efecto de una única inyección de anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del tumor de mama BT474 en ratones SCID

Ab de control 0, 1 mg/kg 1 mg/kg

Tamaño del tumor (mm2)

mg/kg

Ab administrado en los días 0 y 30 IP

día 72 día 77 día 80 día 83 día 85

Días tras la inyección del tumor

Figura 15.

Efecto del anticuerpo 11D4 sobre el crecimiento del tumor de mama BT474 en ratones SCID: Tamaño del tumor en cada animal individual en el día 85

Tamaño del tumor (mm2)

Control de isotipo