Método para ligación nativa de polipéptidos.

Método de preparación de un polipéptido de fórmula:

(III) X1-X''-X2

representando cada X1 y X2 un fragmento peptídico,

y representando X'' un resto de aminoácido que comprende una función tiol, comprendiendo dicho método al menos una etapa de reacción de ligación entre un polipéptido de fórmula:

(I) X1-N(CH2CH2SH)2

y un polipéptido de fórmula:

(II) H-X''-X2.

Método para ligación nativa de polipéptidos Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para la ligación nativa de polipéptidos. La invención también se refiere a polipéptidos funcionalizados útiles para aplicar este método de ligación nativa como así como a un método para preparar estos polipéptidos funcionalizados. La invención también se refiere a un compuesto de amina así como a una resina funcionalizada, útiles para aplicar el método de preparación de polipéptidos funcionalizados.

Antecedentes en la técnica

La síntesis de polipéptidos mediante métodos de fase sólida convencionales, aminoácido a aminoácido, está limitada por bajos rendimientos cuando los polipéptidos sintetizados son de gran tamaño. Para superar esta limitación, se conoce el ensamblaje de los polipéptidos mediante ligación química, para producir un polipéptido más largo.

En general, para la unión entre los polipéptidos ensamblados por ligación es deseable que sean nativos, es decir, que correspondan a la estructura natural de los polipéptidos.

En la actualidad, el método principal para la ligación nativa es el de Kent y Dawson, que se describe, por ejemplo, en los documentos de Patente WO 96/34878 y WO 98/28434. Este método se basa en una reacción quimioselectiva entre un tioéster péptido (C-terminal) y un cisteinil péptido. La desventaja principal de este método es que la preparación de los tioéster péptidos requiere procesos químicos complejos.

Un método alternativo se denomina ligación de Staudinger, que se describe en los documentos de Patente WO 1/68565 y WO 1/8792. Este comprende la reacción de un fosfinotioéster con una azida e hidrólisis de los reactivos combinados para formar un enlace amida. Este método es difícil de aplicar a escala industrial.

Un tercer método, que se describe en el documento de Patente WO 27/37812, se basa en la reacción de un a- cetoácido con una amina en una reacción de condensación descarboxilativa. Sin embargo, los cetoácidos son moléculas que son difíciles de preparar y de incorporar a los péptidos. Además, este tercer método es difícil de aplicar en laboratorios de síntesis peptídica que no están equipados con medios para llevar a cabo síntesis

orgánicas complejas.

Por lo tanto, existe la necesidad real de desarrollar un nuevo método para ligación nativa de polipéptidos, que sea a la vez eficaz y más simple de aplicar, incluyendo a escala industrial.

Sumario de la invención

La invención se refiere en primer lugar a un método de preparación de un polipéptido de fórmula:

(III) XrX"-X2

representando cada Xi yX2 un fragmento peptídico, y representando X" un resto de aminoácido que comprende una función tiol, comprendiendo dicho método al menos una etapa de reacción de ligación entre un polipéptido de fórmula:

(I) Xi-N(CH2CH2SH)2 y un polipéptido de fórmula:

(II) H-X"-X2.

De acuerdo con una realización, la reacción de ligación se lleva a cabo poniendo en contacto un polipéptido de fórmula:

) Xr

N

I '

con el polipéptido de fórmula (II), en presencia de al menos un compuesto que reduce los enlaces disulfuro.

De acuerdo con una realización, X2 representa un fragmento peptídico de fórmula

(iv) x2'-(xr-x;u.n

siendo n un número entero mayor o igual que 3, representando cada X¡", para un i entero comprendido entre 3 y n, un resto de aminoácido que comprende una función tiol, y representando cada X¡', para un i entero comprendido entre 2 y n, un fragmento peptídico; comprendiendo el método, antes de la etapa de reacción de ligación entre el polipéptido de fórmula (I) y el polipéptido de fórmula (II), una sucesión de n-2 etapas de reacción de ligación, siendo la j-ésima etapa de reacción de ligación, para un j entero comprendido entre 1 y n-2, una reacción de ligación entre un polipéptido de fórmula:

(V) H-Xn-j"-Xn.j'- N(CH2CH2SH)2

en la que la función amida y/o la función tiol del resto Xn-j" está protegida, y un polipéptido de fórmula:

(VI) H-(X¡"-X¡l)¡=(n-j+1)...n para formar un polipéptido de fórmula:

(Vil) H-(X¡"-X¡,)i=(n.j)...n

experimentando el polipéptido de fórmula (Vil) la desprotección de la función tiol del resto Xn.j" al final de la reacción de ligación.

De acuerdo con una realización, una o más de las n-2 etapas de reacción de ligación entre el polipéptido de fórmula (V) y el polipéptido de fórmula (VI) se lleva a cabo poniendo en contacto un polipéptido de fórmula:

H-XnV-XnV-

N

r>

con el polipéptido de fórmula:

(VI) H-(Xi"-Xi')i=(n.j+i)...n

siendo j un número entero comprendido entre 1 y n-2, en presencia de al menos un compuesto que reduce los enlaces disulfuro.

La invención también se refiere a un método de preparación de un polipéptido cíclico de fórmula:

(X) [- X"-X2 1

representando X2 un fragmento peptídico, y representando X" un resto de aminoácido que comprende una función tiol, comprendiendo dicho método al menos una etapa de reacción de ligación de un polipéptido de fórmula:

(XI) H-X"-X2-N(CH2CH2SH)2

consigo mismo.

De acuerdo con una realización, la reacción de ligación se lleva a cabo poniendo en contacto un polipéptido de fórmula:

(XI)

H-X"-XrN

I

con al menos un compuesto que reduce los enlaces disulfuro.

De acuerdo con una realización de cualquiera de los métodos anteriores, la reacción de ligación o las reacciones de ligación se llevan a cabo en un medio acuoso, preferentemente a un pH comprendido entre 6,5 y 8,5, de forma más particularmente preferente entre 7 y 8, e Idealmente a aproximadamente 7,5.

De acuerdo con una realización de cualquiera de los métodos anteriores, la reacción de ligación o las reacciones de ligación se llevan a cabo en presencia de al menos un compuesto que reduce los enlaces disulfuro, seleccionado preferentemente entre tris(2-carboxietil)fosfina, ácido 4-mercaptofenilacético, ditiotreitol, bencil mercaptano y las mezclas de los mismos.

La invención también se refiere a un polipéptido de fórmula:

(I) Xi-N(CH2CH2SH)2

o de fórmula:

O)

Xr N

i

en la que Xi representa un fragmento peptídico y el grupo -N(CH2CH2SH)2 o

-N

V

s

s

está unido a la terminación C= del resto de aminoácido del fragmento peptídico Xi que está en posición C-terminal.

De acuerdo con una realización, Xi comprende entre 2 y 3 restos de aminoácido, preferentemente entre 5 y 1 restos de aminoácido, de forma más particularmente preferente entre 8 y 5 restos de aminoácido.

La Invención también se refiere a un método de preparación de un polipéptido de fórmula:

(I) XrN(CH2CH2SH)2

representando Xi un fragmento peptídico, que comprende al menos una etapa de síntesis peptfdica y una etapa de funcionalización C-terminal.

De acuerdo con una realización, la etapa de síntesis peptídica precede a la etapa de funcionalización; la etapa de síntesis peptídica proporciona un polipéptido de fórmula:

(IX) XtOH

que comprende preferentemente grupos protectores en sus funciones amina y carboxllica, con la excepción de su función carboxílica C-terminal; y la etapa de funcionalización comprende:

- la reacción del polipéptido de fórmula (IX) con el compuesto de amina de fórmula:

(VIII) NH(CH2-CH2-S-Gi)2

en la que Gi representa un grupo protector, formando preferentemente dicho grupo protector una función tioéter, tloéster o disulfuro, y siendo de forma más particularmente preferente el grupo trifenilmetilo, en la fase líquida, para formar el polipéptido de fórmula (I);

- opclonalmente la desprotección del polipéptido de fórmula (I).

También es un objeto de la invención un soporte de resina polimérica para la síntesis en fase sólida de polipéptidos, que comprende un esqueleto principal y grupos funcionales NH-(CH2CH2-S-Trt-)2 o grupos funcionales NH-(CH2CH2- S-Trt-CO-NH-)2, en los que Trt representa un grupo trifenilmetilo opclonalmente sustituido con uno o más sustituyeles, seleccionados en particular entre los sustituyeles cloro, metoxi, metilo, flúor y ciano; en el que los grupos funcionales NH-(CH2CH2-S-Trt-)2 están unidos al esqueleto principal mediante los dos grupos trifenilmetilo, o los grupos funcionales NH-(CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2 están unidos al esqueleto principal mediante los dos grupos amina.

También es un objeto de la invención un soporte de resina polimérica para la síntesis en... [Seguir leyendo]

1. Método de preparación de un polipéptido de fórmula:

(III) Xi-X"-X2

representando cada Xi yX2 un fragmento peptídico, y representando X" un resto de aminoácido que comprende una función tiol, comprendiendo dicho método al menos una etapa de reacción de ligación entre un polipéptido de fórmula:

(I) X1-N(CH2CH2SH)2 y un polipéptido de fórmula:

(II) H-X"-X2.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la reacción de ligación se lleva a cabo poniendo en contacto un polipéptido de fórmula:

o X'-VJ

con el polipéptido de fórmula (II), en presencia de al menos un compuesto que reduce los enlaces disulfuro, reduciéndose in situ el polipéptido de fórmula (I1) al polipéptido de fórmula (I) para la reacción de ligación.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que X2 representa un fragmento peptídico de fórmula

(IV) X2'-(Xi"-Xi')i=3...n

siendo n un número entero mayor o igual que 3, representando cada X¡", para un i entero comprendido entre 3 y n, un resto de aminoácido que porta una función tiol, y representando cada X', para un i entero comprendido entre 2 y n, un fragmento peptídico; comprendiendo dicho método, antes de la etapa de reacción de ligación entre el polipéptido de fórmula (I) y el polipéptido de fórmula (II), una sucesión de n-2 etapas de reacción de ligación, siendo la j-ésima etapa de reacción de ligación, para un j entero comprendido entre 1 y n-2, una reacción de ligación entre un polipéptido de fórmula:

(V) H-Xn-j"-Xn-j'- N(CH2CH2SH)2

en la que la función amina y/o la función tiol del resto Xn_j" está protegida y un polipéptido de fórmula:

(VI) H-(X¡"-X¡l)¡=(n-j+1)...n para formar un polipéptido de fórmula:

(Vil) H-(X¡"-X¡l)¡=(n-i)...n

experimentando el polipéptido de fórmula (Vil) la desprotección de la función tiol del resto Xn-j" al final de la reacción de ligación.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que una o más de las n-2 etapas de reacción de ligación entre el polipéptido de fórmula (V) y el polipéptido de fórmula (VI) se lleva a cabo poniendo en contacto un polipéptido de fórmula:

(V') H-Xn-j"Xnj'

N

o

con el polipéptido de fórmula:

(VI) H-(Xi"-Xi')i=(.j+1)...n

siendo j un número entero comprendido entre 1 y n-2, en presencia de al menos un compuesto que reduce los enlaces disulfuro.

5. Método de fabricación de un polipéptido cíclico de fórmula:

(X) |- X -X21

representando X2 un fragmento peptldico, y representando X" un resto de aminoácido que comprende una función tiol,

comprendiendo dicho método al menos una etapa de reacción de ligación de un polipéptido de fórmula:

(XI) H-X"-X2-N(CH2CH2SH)2

consigo mismo.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la reacción de ligación se lleva a cabo poniendo en contacto un polipéptido de fórmula:

/^S

(XI') H-X"-X2-N V

con al menos un compuesto que reduce los enlaces disulfuro, reduciéndose in situ el polipéptido de fórmula (XI1) al polipéptido de fórmula (XI) para la reacción de ligación.

7. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la reacción de ligación o las reacciones de ligación se llevan a cabo en un medio acuoso, preferentemente a un pH comprendido entre 6,5 y 8,5, de forma más particularmente preferente entre 7 y 8, e idealmente a aproximadamente 7,5.

8. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la reacción de ligación o las reacciones de ligación se llevan a cabo en presencia de al menos un compuesto que reduce los enlaces disulfuro, seleccionado preferentemente entre tris(2-carbox¡et¡l)fosfina, ácido 4-mercaptofenilacético, ditiotreitol, bencil mercaptano y las mezclas de los mismos.

9. Polipéptido de fórmula:

(I) Xi-N(CH2CH2SH)2

o de fórmula:

r's

m x,-n^s

en la que X1 representa un fragmento peptldico y el grupo -N(CH2CH2SH)2 o

hO

v_s

está unido a la terminación C= del resto de aminoácido del fragmento peptldico X1 que está en posición C- terminal.

1. Método de preparación de un polipéptido de fórmula:

(I) Xi-N(CH2CH2SH)2

representando X-i un fragmento peptldico y estando unido el grupo -N(CH2CH2SH)2 a la terminación C= del resto de aminoácido del fragmento peptldico X-i que está en posición C-terminal, que comprende al menos una etapa de síntesis peptídica y una etapa de funcionalización C-terminal.

11. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa de síntesis peptídica precede a la etapa de funcionalización; la etapa de síntesis peptídica proporciona un polipéptido de fórmula:

(IX) X1-OH

que comprende preferentemente grupos protectores en sus funciones amina y carboxílica, con la excepción de su función carboxílica C-terminal; y la etapa de funcionalización comprende:

- la reacción del polipéptido de fórmula (IX) con el compuesto de amina de fórmula:

(VIII) NH(CH2-CH2-S-Gi)2

en la que Gi representa un grupo protector, formando preferentemente dicho grupo protector una función tioéter, tioéster o disulfuro, y siendo de forma más particularmente preferente el grupo trifenilmetilo, en la fase liquida, para formar el polipéptido de fórmula (I);

- opcionalmente la desprotección del polipéptido de fórmula (I).

12. Soporte de resina polimérica para síntesis de polipéptidos en fase sólida, que comprende un esqueleto principal y grupos funcionales NH-(CH2CH2-S-Trt-)2 o grupos funcionales NH-(CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2 o grupos funcionales G2-AA-N-(CH2CH2-S-Trt-)2 o grupos funcionales G2-AA-N-(CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2, en los que Trt representa un grupo trifenilmetilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes, seleccionados en particular entre los sustituyentes cloro, metoxi, metilo, flúor y ciano; AA representa un resto de aminoácido que porta opcionalmente uno o más grupos protectores; G2 representa un átomo de hidrógeno o un grupo que protege la función amina; en el que los grupos funcionales NH-(CH2CH2-S-Trt-)2 o los grupos funcionales G2-AA-N(CH2CH2-S-Trt-)2 están unidos al esqueleto principal mediante los dos grupos trifenilmetilo, o los grupos funcionales NH-(CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2 o los grupos funcionales G2-AA-N-(CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2 están unidos al esqueleto principal mediante los dos grupos amina.

13. Soporte de resina polimérica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el esqueleto principal se selecciona entre los esqueletos de poliestireno, poliacrilamida, polietilenglicol, celulosa, polietileno, poliéster, látex, poliamida, polidlmetllacrilamida, copolímero de polietilenglicol-poliestireno, copolímero de polietilenglicol-poliacrilamida y los derivados de los mismos.

14. Método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que:

- la etapa de funcionalización precede a la etapa de síntesis peptldica;

- la etapa de funcionalización comprende:

el acoplamiento de un aminoácido a un soporte de resina polimérica de acuerdo con la reivindicación 12 que comprende un esqueleto principal y grupos funcionales NH-(CH2CH2-S-Trt-)2 o grupos funcionales NH- (CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2, para suministrar un soporte cebador; o

el suministro de un soporte cebador que es un soporte de resina polimérica de acuerdo con la reivindicación 12 que comprende un esqueleto principal y grupos funcionales G2-AA-N-(CH2CH2-S-Trt-)2 o grupos funcionales G2-AA-N-(CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2;

- la etapa de síntesis peptldica comprende una sucesión de acoplamientos de aminoácidos sobre el soporte cebador.

15. Método de preparación de un polipéptido de fórmula:

(!')

Xi-N

I '

en el que Xi representa un fragmento peptídlco y el grupo

-N

j '

V^s

está unido a la terminación C= del resto de aminoácido del fragmento peptídico Xi que está en la posición C- terminal, que comprende una etapa de oxidación de un polipéptido de fórmula:

(I) X1-N(CH2CH2SH)2

preferentemente en contacto con aire, o en presencia de l2 o de diamida, y en un tampón, estando precedida preferentemente dicha etapa de oxidación por una etapa de preparación del polipéptido de fórmula (I) de acuerdo con el método de las reivindicaciones 1, 11, o 14.