Método para inmovilizar conjugados en pruebas diagnósticas.

Método para detectar un analito en una muestra, que comprende las siguientes etapas:

(a) preparación de una fase sólida que comprende una zona de detección del analito y una zona decontrol, de manera que la zona de detección del analito sirve para la determinación cuantitativa y/o cualitativadel analito contenido en la muestra y la zona de control para la comprobación de la funcionalidad del reactivode ensayo;

(b) puesta en contacto de la fase sólida con la muestra y el reactivo de ensayo, el cual contiene unreceptor libre específico del analito y al menos un elemento estructural heterólogo para una fijación específicaa la zona de control, de manera que el elemento estructural heterólogo es independiente de lascaracterísticas del receptor que son específicas para el analito y se elige entre haptenos, péptidos de hasta25 aminoácidos o biotina, y el receptor libre va unido al menos a un elemento estructural heterólogo, y

(c) determinación de la presencia y/o de la cantidad del analito en la muestra mediante la zona dedetección y comprobación de la funcionalidad del ensayo, de modo que en la zona de control hay un receptoro componente de unión inmovilizado, que es específico para el elemento estructural heterólogo.

Método para inmovilizar conjugados en pruebas diagnósticas La presente invención se refiere a un método de detección de un analito en una muestra, con el uso de conjugados específicos del analito que presentan al menos un grupo heterólogo para una unión independiente del analito a una zona de control. Además la presente invención ofrece nuevos kits de reactivos.

Para detectar analitos – p.ej. sustancias de importancia diagnóstica – en una muestra se usan reactivos específicos del analito, por ejemplo componentes de unión específicos del analito buscado y/o análogos del mismo. En el caso de los métodos de detección heterogéneos se usa una fase sólida para fijar el analito, de manera que éste se separe de otros componentes de cara a la determinación cualitativa o cuantitativa. Esta fijación a una fase sólida la puede facilitar otro receptor específico del analito que se une a la fase sólida antes o durante la realización del ensayo. En un método de detección según el principio del ensayo sándwich se puede fijar un componente de unión específico del analito a la fase sólida y detectar el analito mediante un componente de unión libre, específico del analito, que lleve un grupo marcador. En un método de detección competitivo, como reactivo específico del analito en la fase sólida también se puede usar un componente de unión específico del analito y detectar éste indirectamente, fijando a la fase sólida un análogo del mismo libre y marcado.

Una forma de ejecución técnica especial de los métodos de detección heterogéneos son las tiras de ensayo que llevan una zona de detección definida para la determinación cuantitativa o cualitativa del analito. El receptor libre, específico del analito, usado en la detección lleva preferiblemente una marcación directa, es decir un grupo emisor de una señal directa, por lo cual, además de una determinación cuantitativa con un aparato, también es posible una valoración visual cualitativa del ensayo.

Además de la zona de detección del analito, las tiras de ensayo diagnósticas también contienen una zona de control que permite al usuario reconocer la diferencia entre un resultado negativo del ensayo y un uso incorrecto o defecto funcional del mismo. En general dicha zona de control está configurada para permitir la inmovilización del receptor libre específico del analito, independientemente de la presencia del analito en la muestra. Por lo tanto, si el ensayo funciona correctamente, esta zona de control se tiñe en cualquier caso.

La fijación del receptor libre específico del analito a la zona de control puede realizarse por distintos procedimientos. Si el receptor libre específico del analito es un componente de unión específico del mismo, en la zona de control se puede inmovilizar el analito, un análogo del analito o un epítopo del mismo, con lo cual se capta el componente de unión libre del analito. Por consiguiente, si el componente de unión libre es un anticuerpo, para la zona de control se puede usar un antígeno que reaccione con el anticuerpo, un análogo de dicho antígeno o un epítopo del mismo.

Sin embargo en algunos casos esta forma de ejecución no es realizable, porque el analito no está suficientemente disponible o/y caracterizado para poder preparar análogos o/y epítopos del mismo, y/o porque el componente de unión específico reconoce regiones del analito que no son reproducibles como epítopo o ya no son accesibles tras la inmovilización sobre la tira de ensayo.

Hasta ahora, en estos casos se usaba un receptor dirigido contra una región homóloga del componente de unión no fijadora del analito, para captar el componente de unión libre específico del analito en la zona de control de la tira de ensayo. Cuando el componente de unión era un anticuerpo, como receptores de control se usaban anti-anticuerpos que reconocen la región constante del anticuerpo detector o bien otros reactivos capaces de fijar específicamente inmunoglobulinas, p.ej. proteína A o proteína G.

Para llegar a una conclusión válida sobre el resultado de un método de detección heterogéneo en formato de tira de ensayo es esencial que haya una reacción señalizadora de la zona de control, pues solo así se puede comprobar el correcto funcionamiento de la tira de ensayo. La coloración de solo la zona de control debe interpretarse como el resultado negativo de un ensayo operativo, mientras que una coloración adicional de la zona de detección del analito significa que el resultado ha sido positivo; dicho en general, que se ha detectado la presencia de un analito en la muestra analizada.

La fijación que fundamenta la coloración de la zona de control puede ser alterada por distintas causas. Por ejemplo, en caso de elevadas concentraciones de analito en la muestra se puede agotar en gran medida la capacidad del componente de unión libre del analito, de modo que ya no pueda unirse, o no suficientemente, con un analito o con un epítopo o análogo del mismo inmovilizado en la zona de control. Entonces la zona de control ya no se colorea o solo débilmente (efecto Hook) .

El empleo de otros receptores independientes del reconocimiento del analito por el componente de unión, como p.ej. sustancias fijadoras de anticuerpos, sobre todo anti-anticuerpos como reactivos de fijación, en la región de control de la tira de ensayo disminuye el riesgo de una pérdida de funcionalidad por efecto Hook. Sin embargo este modelo de control de las tiras de ensayo tiene otras serias desventajas. En muchos casos se utilizan como muestras sustancias biológicas como sangre, plasma o suero. El especialista ya sabe que estas sustancias llevan componentes capaces

de fijar anticuerpos, las cuales pueden alterar un ensayo inmunológico con anticuerpos como reactivos específicos de unión y detección, dando falsos resultados positivos o negativos. Para prevenir estas mediciones erróneas, como componentes supresores solían adicionarse inmunoglobulinas inespecíficas de aquellas especies animales de las cuales proceden los anticuerpos de detección específicos. La cantidad de estos anticuerpos supresores sobrepasa en gran medida la cantidad de los anticuerpos de detección específicos. Se pueden unir a los reactivos fijadores de la región de control de la tira de ensayo dirigidos contra los anticuerpos de detección y por lo tanto compiten con el reactivo de detección por los sitios de unión. Entonces se fijan menores cantidades de reactivo de detección y la coloración de la zona de control resulta mucho más débil o no tiene lugar en absoluto.

La patente WO 96/38720 revela un dispositivo de ensayo cromatográfico para detectar y/o determinar un analito en un ensayo inmunológico competitivo.

La patente EP 0 833 157 B1 revela unos reactivos que pueden emplearse en ensayos inmunológicos y dispositivos para utilizar estos reactivos.

El objeto de la presente invención consiste en proporcionar métodos de detección heterogéneos con unas zonas de control que no tengan los inconvenientes del estado técnico arriba descritos.

La presente invención está definida por las reivindicaciones.

Este objetivo se resuelve con la utilización de receptores libres específicos del analito derivatizados, es decir, se introduce uno o varios elementos estructurales heterólogos que no existían anteriormente en el receptor libre y con independencia de su marcación y naturaleza fijan específicamente el analito o un componente de unión del mismo. Gracias al nuevo elemento estructural introducido, el receptor derivatizado puede ser reconocido y fijado por un receptor dirigido contra él. Este otro receptor se inmoviliza en la zona de control de la fase sólida empleada para un ensayo heterogéneo y por tanto es posible captar en esta zona el receptor libre marcado. La cantidad de analito en la muestra no influye en la reacción de captura.

El elemento estructural heterólogo que permite fijar el receptor se puede seleccionar excluyendo ampliamente otras reacciones que interfieren en la unión con el receptor, p.ej. mediante sustancias supresoras.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para detectar un analito, según la reivindicación 1.

El método de la presente invención es especialmente adecuado para las fases sólidas de material poroso, como por ejemplo tiras de ensayo absorbentes. No obstante también sirve para otros tipos de fase sólida, p.ej. para materiales soporte no porosos en forma matricial que, además de una o varias zonas de fijación de analitos, también poseen zonas de control espacialmente definidas.

La zona de detección de analito de la fase sólida está configurada preferiblemente de modo que sobre ella... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar un analito en una muestra, que comprende las siguientes etapas:

(a) preparación de una fase sólida que comprende una zona de detección del analito y una zona de control, de manera que la zona de detección del analito sirve para la determinación cuantitativa y/o cualitativa del analito contenido en la muestra y la zona de control para la comprobación de la funcionalidad del reactivo de ensayo;

(b) puesta en contacto de la fase sólida con la muestra y el reactivo de ensayo, el cual contiene un receptor libre específico del analito y al menos un elemento estructural heterólogo para una fijación específica a la zona de control, de manera que el elemento estructural heterólogo es independiente de las características del receptor que son específicas para el analito y se elige entre haptenos, péptidos de hasta 25 aminoácidos o biotina, y el receptor libre va unido al menos a un elemento estructural heterólogo, y

(c) determinación de la presencia y/o de la cantidad del analito en la muestra mediante la zona de detección y comprobación de la funcionalidad del ensayo, de modo que en la zona de control hay un receptor

o componente de unión inmovilizado, que es específico para el elemento estructural heterólogo.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la zona de detección del analito lleva un receptor inmovilizado que es específico del analito.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el receptor libre lleva un grupo señalizador o un grupo capaz de unirse a un grupo señalizador. 25

4. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque el grupo señalizador es del tipo detectable mediante métodos ópticos y se elige especialmente entre partículas metálicas, colorantes y fluorescentes, p.ej. partículas de látex y partículas de sílice.

5. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la fase sólida contiene un material poroso.

6. Método según la reivindicación 5, caracterizado porque la fase sólida está formada como tira de ensayo absorbente. 35

7. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la fase sólida tiene forma matricial.

8. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el elemento estructural heterólogo

está unido por enlace covalente al receptor libre. 40

9. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el elemento estructural heterólogo para la zona de control se introduce en el receptor libre mediante una reacción de derivatización.

10. Método según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el receptor libre y el elemento 45 estructural heterólogo están coinmovilizados sobre una partícula.

11. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el receptor libre comprende un componente de unión específico del analito.

12. Método según una de las anteriores reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el receptor libre incluye un análogo del analito.

13. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el receptor libre se elige entre péptidos, polipéptidos, glicoproteínas, lipoproteínas, ácidos nucleicos, análogos de ácidos nucleicos, sacáridos, 55 polisacáridos y otras sustancias biológicas.

14. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el receptor libre se elige entre anticuerpos y fragmentos de anticuerpo.

15. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se usa un reactivo de ensayo que además contiene sustancias estructuralmente parecidas al receptor libre, pero que son específicas del analito.

16. Uso del método según una de las reivindicaciones anteriores para detectar analitos de interés diagnóstico en muestras biológicas. 65

17. Uso según la reivindicación 16 en un método de detección inmunológico o en un método de hibridación de ácidos nucleicos.

18. Kit de reactivos para detectar un analito en una muestra, que comprende 5

(a) una fase sólida que comprende una zona de detección del analito y una zona de control, de manera que la zona de detección del analito sirve para la determinación cuantitativa y/o cualitativa de los analitos contenidos en la muestra y la zona de control para la comprobación de la funcionalidad del reactivo de ensayo, de manera que la zona de detección del analito contiene un receptor inmovilizado o inmovilizable específico del

analito y en la zona de control hay un receptor o componente de unión inmovilizado que es específico del elemento estructural heterólogo;

(b) un reactivo de ensayo que comprende un receptor libre específico del analito y es un anticuerpo, y al menos un elemento estructural heterólogo para una unión específica a la zona de control, el cual es independiente de las características del receptor que son específicas para el analito y el receptor libre está unido al menos a un elemento estructural heterólogo que se elige entre haptenos, péptidos de hasta 25 aminoácidos o biotina;

(c) una sustancia no específica del analito que es un anticuerpo de la misma especie y/o de la misma clase 20 de inmunoglobulinas que el receptor libre.

19. Kit de reactivos según la reivindicación 18, caracterizado porque el receptor libre lleva un grupo señalizador o un grupo capaz de unirse a un grupo señalizador.

20. Kit de reactivos según la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque la fase sólida comprende un material poroso.

21. Empleo de un kit de reactivos según una de las reivindicaciones 18 a 20 en un método de detección de un analito. 30

22. Empleo según la reivindicación 21 en un método según una de las reivindicaciones 1 a 15.