Método para incrementar el rendimiento de la expresión de proteínas dependientes de vitamina K.

Procedimiento para la fermentación de células eucariotas que expresan una o varias proteínas dependientes de vitamina K,

en el que uno o varios compuestos seleccionados a partir de una lista que comprende

i) formas reducidas de la vitamina K y/o

ii) formas reducidas de un análogo de la vitamina K y/o

iii) formas reducidas de un precursor de la vitamina K

se añaden al medio de cultivo celular antes y/o durante el proceso de fermentación, en donde el análogo de la vitamina K comprende una estructura de anillo 2-metil-1,4-naftoquinona y se puede sustituir funcionalmente por vitamina K1 en la gamma carboxilación dependiente del ciclo de la vitamina K, de residuos de ácido glutámico por residuos Gla en proteínas dependientes de vitamina K.

Mïtodo para incrementar el rendimiento de la expresiïn de proteïnas dependientes de vitamina K

La vitamina K estï implicada en la carboxilaciïn de determinados residuos de ïcido glutïmico en proteïnas para formar residuos gamma-carboxiglutamato (residuos Gla) . Los residuos modificados se encuentran dentro de dominios proteicos especïficos denominados dominios Gla. Los residuos Gla estïn implicados frecuentemente en la uniïn al calcio. Los residuos Gla son esenciales para la actividad biolïgica de todas las proteïnas Gla conocidas.

La bioquïmica de cïmo se utiliza la vitamina K para convertir Glu a Gla se ha aclarado a lo largo de los ïltimos treinta aïos. Dentro de la cïlula, la vitamina K se somete a una reducciïn electrïnica para pasar a una forma reducida de vitamina K (denominada vitamina K hidroquinona) a travïs de la enzima epïxido reductasa de vitamina K (VKOR) . El gen que codifica VKOR (VKORC1) se ha identificado recientemente, y se describe con detalle en Rost et al., 2004 ( (2004) Nature, 427, 537-541) ) . Otra enzima oxida a continuaciïn la vitamina K hidroquinona para permitir la carboxilaciïn de Glu a Gla; esta enzima se llama gamma-glutamil carboxilasa o carboxilasa dependiente de vitamina K (VKGC) . La reacciïn de carboxilaciïn continuarï solo si la enzima carboxilasa es capaz de oxidar la vitamina K hidroquinona a vitamina K epïxido al mismo tiempo; las reacciones de carboxilaciïn y de epoxidaciïn se dice que son reacciones acopladas. La vitamina K epïxido se vuelve a convertir despuïs en vitamina K a travïs de la epïxido reductasa de vitamina K. Estas dos enzimas comprenden el ciclo denominado de la vitamina K. http://en.wikipedia.org/wiki/Vitamin K-cite note-Stafford-28#cite note-Stafford-28

En la actualidad, las siguientes proteïnas humanas que contienen Gla han sido caracterizadas a nivel de estructura primaria: los factores de coagulaciïn sanguïnea Il (protrombina) , VII, IX y X, las proteïnas anticoagulantes C y S, y la proteïna Z que se dirige al factor X, asï como la proteïna Gla ïsea osteocalcina, la proteïna Gla de la matriz que inhibe la calcificaciïn (MGP) , la proteïna del gen 6 especïfica de la detenciïn del crecimiento (Gas6) que regula el crecimiento celular, y las cuatro proteïnas Gla transmembranales (TMGPs) de funciïn todavïa desconocida. Gas6 puede actuar como un factor de crecimiento que activa la cinasa de tirosina del receptor Axl y estimula la proliferaciïn celular o evita la apoptosis en algunas cïlulas. En todos los casos en los que se conocïa su funciïn, la presencia de residuos Gla en estas proteïnas resultï ser esencial para una actividad funcional. Los mïltiples residuos Gla permiten que el dominio Gla sufra cambios conformacionales que son necesarios para la actividad de las proteïnas dependientes de vitamina K, en combinaciïn con la uniïn a superficies de membranas de fosfolïpidos.

Las proteïnas de la coagulaciïn de la sangre dependientes de vitamina K requieren una carboxilaciïn completa o casi completa para unirse a las superficies de membranas en presencia de iones de calcio. Si antagonistas de la vitamina K inhiben la gamma carboxilaciïn, las proteïnas dependientes de vitamina K hipocarboxiladas no pueden por tanto formar la estructura dependiente de calcio que produce como resultado una baja afinidad hacia las membranas de fosfolïpidos y menos actividad. La falta de actividad procoagulante de los mutantes del Factor IX hipocarboxilados encontrados en pacientes con hemofilia B, se puede asignar a deficiencias en los cambios conformacionales inducidos por calcio y a una pïrdida de la capacidad para unirse a vesïculas de fosfolïpidos.

La biotecnologïa ha brindado la esperanza de producir productos biofarmacïuticos econïmicos. En cuanto a los factores de coagulaciïn, esta prometïa una oportunidad para proporcionar un tratamiento adecuado a una amplia variedad de hemofïlicos. Desafortunadamente, esta promesa no se ha cumplido debido en gran parte a la complejidad inherente de las molïculas biolïgicas de origen natural y a una variedad de limitaciones asociadas con la sïntesis de sus homïlogos proteicos recombinantes en cïlulas manipuladas genïticamente.

La presente solicitud se dirige a la necesidad de un mïtodo para producir proteïnas dependientes de vitamina K, tales como el Factor IX o el Factor VII/VIIa que han sido procesadas correctamente de modo que son activas y tienen un rendimiento suficiente para su producciïn comercial. Para aumentar la disponibilidad de proteïnas de la coagulaciïn sanguïnea dependientes de vitamina K, para satisfacer la necesidad mïdica mundial de tratamiento de trastornos hemorrïgicos tales como la hemofilia B, son necesarias unas mejoras en la producciïn de una proteïna completamente funcional, el Factor IX en este ejemplo, a partir de cïlulas modificadas genïticamente. Especïficamente, se necesita una identificaciïn y complementaciïn de las deficiencias en las actividades enzimïticas requeridas para obtener una modificaciïn postraduccional esencialmente completa.

Por lo tanto, existe una gran necesidad de mejorar la expresiïn, en particular la expresiïn recombinante de las proteïnas dependientes de vitamina K en organismos hospedadores, que produzca una mejora de las tasas y/o las actividades secretoras de las proteïnas dependientes de vitamina K expresadas.

La hipoexpresiïn recombinante de las proteïnas gamma carboxiladas en el caso del Factor IX humano se observï que daba lugar a una limitaciïn de la escisiïn del propïptido y una gamma carboxilaciïn con mayores tasas de secreciïn, produciendo de este modo proteïnas que solo estïn ocupadas parcialmente con residuos Gla, tambiïn cuando la vitamina K estï disponible en exceso en el medio de cultivo. Esto conduce a la secreciïn de variantes de proteïnas recombinantes dependientes de vitamina K, con actividades reducidas. La adiciïn de vitamina K en el medio no mejorï la actividad del Factor IX a niveles de expresiïn elevados. Se observï que el requisito de vitamina K presente en el medio de cultivo celular para obtener Factor IX activo, alcanzaba la saturaciïn en 5 μg/ml. Por debajo de este nivel, la cantidad secretada de Factor IX activo a partir de cïlulas de ovario de hïmster chino (CHO) era de

pendiente de la concentraciïn de vitamina K (Kaufman, R. J. et al. (1986) , J. Biol. Chem., 261, 9622-9628) .

La vitamina K y los anïlogos de la vitamina K comprenden un grupo de vitaminas lipïfilas, hidrïfobas que poseen una estructura comïn de 2-metil-1, 4-naftoquinona, llamada menadiona.

Todos los miembros del grupo de vitaminas de la vitamina K comparten una estructura de anillo de naftoquinona metilada, y varïan en la cadena lateral alifïtica fijada en la posiciïn 3.

Las plantas y las cianobacterias, casi invariablemente, sintetizan solo una forma quïmica llamada filoquinona (tambiïn conocida como vitamina K1) que tiene la misma cadena lateral de fitilo que en la clorofila.

Las menaquinonas (tambiïn conocidas como vitaminas K2) producidas normalmente por bacterias en el intestino, se diferencian de la filoquinona porque la cadena lateral 3 comprende, en su mayor parte, un polïmero de unidades repetidas de prenilo en lugar de la cadena de fitilo. Para efectos de nomenclatura, las menaquinonas se clasifican de acuerdo con el nïmero de unidades de prenilo, proporcionïndose este nïmero como un sufijo (es decir, menaquinona-n, abreviada como Mk-n) . Algunas de las unidades de prenilo tambiïn pueden estar saturadas lo que se indica por el prefijo dihidro, tetrahidro, y asï sucesivamente y se abrevian como Mk-n (H2) , Mk-n (H4) , etc.

En general se acepta que la naftoquinona es el grupo funcional, de modo que el mecanismo de acciïn es similar para todos las vitaminas K.

Tambiïn se ha observado en un sistema exento de cïlulas que la menadiona y la menadiona reducida son inactivas para favorecer la gamma carboxilaciïn (Sadowski et al. (1976) , J. Biol. Chem. Vol. 251, nï 9 pïgs. 2770-2776) .

Ademïs de aïadir vitamina K al medio de cultivo celular, se han intentado otros medios para mejorar la expresiïn de la vitamina K funcional.

La hiperexpresiïn de la gamma-carboxilasa dependiente de vitamina K (VKGC) , no ha dado lugar una secreciïn mejorada de proteïnas en caso del Factor IX (Rehemtulla, A. et al. (1993) PNAS 90, 4611-4615) .

Recientemente, algunos grupos mostraron que la coexpresiïn tanto de VKGC como de VKOR puede aumentar el nivel de expresiïn de proteïnas dependientes de vitamina K funcionales (documentos WO 2005/030039, WO 2005/040367, WO 2006/089613, WO 2006/101474, WO 2007/065173 y WO 2007/075976) .

COMPENDIO DE LA INVENCIïN

Los inventores de la presente invenciïn... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la fermentaciïn de cïlulas eucariotas que expresan una o varias proteïnas dependientes de vitamina K, en el que uno o varios compuestos seleccionados a partir de una lista que comprende i) formas reducidas de la vitamina K y/o ii) formas reducidas de un anïlogo de la vitamina K y/o iii) formas reducidas de un precursor de la vitamina K

se aïaden al medio de cultivo celular antes y/o durante el proceso de fermentaciïn, en donde el anïlogo de la vitamina K comprende una estructura de anillo 2-metil-1, 4-naftoquinona y se puede sustituir funcionalmente por vitamina K1 en la gamma carboxilaciïn dependiente del ciclo de la vitamina K, de residuos de ïcido glutïmico por residuos Gla en proteïnas dependientes de vitamina K.

2. Procedimiento segïn la reivindicaciïn 1, en el que los factores de coagulaciïn dependientes de vitamina K se seleccionan a partir de una lista que consiste en FIX, FVII, FX, FII, Proteïna C, Proteïna S, Proteïna Z, osteocalcina, la proteïna Gla de la matriz que inhibe la calcificaciïn (MGP) o la proteïna del gen 6 especïfica de la detenciïn del crecimiento (Gas6) que regula el crecimiento celular.

3. Procedimiento segïn la reivindicaciïn 2, en el que los factores de coagulaciïn dependientes de vitamina K son FIX o FVII.

4. Procedimiento segïn las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anïlogo de la vitamina K reducida es bisulfito de menadiona reducido.

5. Procedimiento segïn las reivindicaciones 1 a 4, en el que la expresiïn se realiza en un biorreactor.

6. Procedimiento segïn las reivindicaciones 1 a 5, en el que la fermentaciïn se efectïa en un modo de extracciïn y relleno, un modo por lotes o un modo por perfusiïn.

7. Procedimiento segïn las reivindicaciones 1 a 6, en el que la fermentaciïn se realiza utilizando cïlulas en suspensiïn o con cïlulas adherentes.

8. Uso de uno o varios compuestos seleccionados a partir de una lista que comprende

i) formas reducidas de la vitamina K y/o ii) formas reducidas de un anïlogo de la vitamina K y/o iii) formas reducidas de un precursor de la vitamina K

para la expresiïn de una o varias proteïnas funcionales dependientes de vitamina K en cultivo celular mediante la adiciïn de dichos compuestos al medio de cultivo celular, en donde el anïlogo de la vitamina K comprende una estructura de anillo 2-metil-1, 4-naftoquinona y se puede sustituir funcionalmente por vitamina K1 en la gamma carboxilaciïn dependiente del ciclo de la vitamina K, de residuos de ïcido glutïmico por residuos Gla en proteïnas dependientes de vitamina K.

9. Uso segïn la reivindicaciïn 8, en el que la relaciïn de la actividad frente al nivel de expresiïn de antïgeno de la proteïna dependiente de vitamina K se incrementa.

10. Uso segïn las reivindicaciones 8 a 9, en el que el anïlogo de la vitamina K reducida es bisulfito de menadiona reducido.

11. Uso segïn las reivindicaciones 8 a 10, en donde la expresiïn se realiza en un biorreactor.

12. Uso segïn las reivindicaciones 8 a 11, en donde la fermentaciïn se efectïa en un modo de extracciïn y relleno.

13. Medio para la fermentaciïn de proteïnas dependientes de vitamina K complementadas con una forma reducida de la vitamina K y/o un anïlogo de la vitamina K y/o un precursor de la vitamina K, en donde el anïlogo de la vitamina K comprende una estructura de anillo 2-metil-1, 4-naftoquinona y se puede sustituir funcionalmente por vitamina K1 en la gamma carboxilaciïn dependiente del ciclo de la vitamina K, de residuos de ïcido glutïmico por residuos Gla en proteïnas dependientes de vitamina K.

14. Medio segïn la reivindicaciïn 13, complementado con bisulfito de menadiona reducido.

15. Uso de formas reducidas de la vitamina K y/o un anïlogo de la vitamina K y/o un precursor de la vitamina K en el medio de cultivo celular para mejorar la viabilidad de las cïlulas en fermentaciïn, en donde el anïlogo de la vi

tamina K comprende una estructura de anillo 2-metil-1, 4-naftoquinona y se puede sustituir funcionalmente por vitamina K1 en la gamma carboxilaciïn dependiente del ciclo de la vitamina K, de residuos de ïcido glutïmico por residuos Gla en proteïnas dependientes de vitamina K.