Método para fabricar un compuesto que disminuya los lípidos en sangre y elevar las lipoproteínas de alta densidad.

Método de elaboración de un compuesto para reducir los lípidos en sangre y elevar la concentración de lipoproteína de alta densidad.

Este método consta de los siguientes pasos:

(1) Obtener un producto fermentado con Monascus;

(2) tratar el producto fermentado con Monascus tres veces con acetona, estando la relación producto fermentado : acetona en el rango 1:10 ~ 1:50;

(3) elevar la concentración del producto obtenido en el paso previo por un proceso de descompresión en un rango de temperatura entre 40ºC ~60ºC;

(4.1) añadir el producto obtenido en el paso (3) a una columna de gel de sílice;

(4.2) añadir una serie de soluciones de lavado a la columna de gel de sílice de forma secuencial, de acuerdo con el paso (4.2), hexano, hexano : etanol ≥ 9:1, hexano : etanol ≥ 8:2, hexano : etanol ≥ 7:3, hexano : etanol ≥ 1:1, y etanol;

(4.3) recoger 12~15 fracciones de las que fluyen desde la columna de gel de sílice;

(4.4) analizar las fracciones recogidas en el paso previo con cromatografía líquida de alta eficacia junto con una matriz de fotodiodos (HPLC-PDA), y conservar las fracciones que contengan monascina y ankaflavina;

(4.5) mezclar las fracciones conseguidas en el paso previo para formar una fracción de pigmento;

(5) separar la fracción de pigmento amarillo de la fracción de pigmento con una cromatografía en columna Sephadex LH-20;

(6.1) añadir la fracción de pigmento obtenida en el paso (5) a una columna de gel de sílice;

(6.2) añadir una serie de soluciones de lavado a la columna de gel de sílice de forma secuencial, de acuerdo con el paso (6.2), diclorometano : etanol ≥ 95:5, diclorometano : etanol ≥ 9:1, and diclorometano : etanol ≥ 4:1;

(6.3) recoger 3~5 fracciones de las que fluyen desde la columna de gel de sílice;

(6.4) analizar las fracciones recogidas en el paso previo por HPLC-PDA, y recoger las fracciones que contengan monascina y ankaflavina;

(6.5) mezclar las fracciones recogidas en el paso previo para formar una fracción específica que contenga 25 monascina y ankaflavina;

(7.1) lavar y separar la fracción específica que contiene monascina y ankaflavina obtenida en el paso (6) por columna C18 en combinación con cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) y una solución de lavado metanol:agua ≥ 85:15;

(7.2) recoger dos fracciones de las que fluyen de la columna C18; y

(7.3) analizar las fracciones recogidas en el paso previo con HPLC-PDA, y recoger las fracciones que contengan monascina.

Método para fabricar un compuesto que disminuya los lípidos en sangre y elevar las lipoproteínas de alta densidad. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. Ámbito de la Invención

La presente invención relaciona métodos para elaborar un compuesto que disminuye los lípidos en sangre y eleva las lipoproteínas de alta densidad, y más particularmente la fabricación de un compuesto que contiene monascina o ankaflavina, o una combinación de los mismos, para reducir los lípidos en sangre y elevar las lipoproteínas de alta densidad.

2. Descripción de los antecedentes

El contenido del colesterol en sangre está directamente vinculado a la incidencia de las enfermedades cardiovasculares. De acuerdo con estudios previos, la dislipidemia juega un importante papel en las enfermedades cardiovasculares, por lo que la concentración del colesterol en sangre puede ser un buen indicador de las mismas. Cuando la concentración del colesterol sérico es más de 200mg/dL, la probablilidad de defunción por enfermedad coronaria se incrementa rápidamente. Una persona con alto contenido de colesterol debería tener un alto índice de morbidez por enfermedad coronaria y un alto índice de mortalidad, pero si el contenido de colesterol se reduce debido a un tratamiento médico o por un proceso no médico, el índice de incidencia de las enfermedades cardiovasculares causadas por esclerosis coronarla puede reducirse significativamente.

En los últimos años, se están desarrollando todo tipo de productos alimenticios saludables, y gradualmente se está prestando más atención a los productos fermentados con Monascus. En Asia, la aplicación de diferentes especies de Monascus en alimentos y medicina tiene miles de años de historia.

Los importantes metabolltos secundarios de la especie Monascus incluyen: (1) un grupo de pigmentos, incluyendo pigmentos rojos (rubropunctamina y monascorubramina), pigmentos amarillos (ankaflavina y monascina) y pigmentos naranjas (rubropunctanina y monascorubrina); (2) Sustancias reductoras del colesterol, como la monacolina K (también llamada lovastatina, mevinolina y Mevacor); (3) sustancias reductoras de la presión sanguínea, como el ácido y-aminobutírico (GABA); y (4) antloxldantes, Incluyendo los ácidos dlmerumlco y 3- hidroxl-4-metoxi-benzoico.

De los metabolitos secundarios de las especies Monascus mencionados más arriba, la monacolina K puede reducir la actividad de la hidroxil metilglutaril-CoA reductasa (HMG-CoA reductasa), que es una enzima clave en el proceso de biosíntesis del colesterol, por lo que la monacolina K tiene un efecto significativo en la reducción del colesterol.

Por otra parte, el colesterol en sangre puede dividirse en dos categorías de acuerdo a su densidad: la Llpoproteína de Alta Densidad - Colesterol (HDL-C) y la Llplproteína de Baja Densidad - Colesterol (LDL-C). Muchas Investigaciones indican que el HDL-C es una especie de colesterol bueno, y LDL-C es un colesterol malo. Una alta concentración de HDL-C y una baja concentración de LDL-C también ayudan a reducir la Incidencia de las enfermedades cardiovasculares y la arteriesclerosis.

Dado que el colesterol total (TC) incluye el HDL-C, LDL-C, trlgllcérldos (TG) y otros colesteroles de lipoproteínas, puede ser que el Incremento de HDL-C y LDL-C venga acompañado de un Incremento del TC y viceversa. Muchas investigaciones apuntan que al reducir el nivel de TC con medicamentos reductores del colesterol, también se reduce en gran medida la concentración del HDL-C. Sin embargo, si se mantiene o eleva la concentración de HDL-C, se consigue prevenir enfermedades cardiovasculares.

Sin embargo, aunque la ya mencionada monacolina K tiene el efecto de reducir el colesterol, no eleva la concentración de HDL-C, y por tanto, el efecto de prevenir enfermedades cardiovasculares y arterlosclerosls empleando monacolina K es muy limitado.

En vista de esto, es necesario proporcionar un compuesto novedoso y los medios para fabricarlo, cuya formulación tenga el efecto de reducir los lípidos en sangre y elevar la concentración de HDL-C simultáneamente, para reducir la incidencia de enfermedades cardiovasculares y arteriesclerosis de forma efectiva.

Los siguientes documentos describen métodos utilizados con anterioridad para elaborar compuestos de ankaflavlna/monascina:

DATABASE WPI, Week 201113 Thomson Scientific, Londres, GB; AN 2010-P32505, & CN 101 864 191 A (UNIV FUZHOU) 20 de octubre de 2010.

FIELDING B C ET AL: " THE CHEMISTRY OF FUNGI. PART XXXIX. THE STRUCTURE OF MONASCIN", JOURNAL OF THE CHEMICAL SOCIETY, CHEMICAL SOCIETY, LETCHWORTH; GB, 1 de enero de 1961, pág. 4579-4589.

DATABASE WPI, Week 199727 Thomson Scientific, Londres, GB;

AN 1997-290194 XP002667421, & CN 1 103 891 A (JIANGMEN BIOTECHNOLOGY DEV CENT GUANGDON) 21 JUNE 1995.

RESUMEN DE LA INVENCION

En vista de las deficiencias mencionadas anteriormente, los investigadores recurrieron a su experiencia, imaginación y creatividad, realizaron experimentos e investigaciones repetidamente, y finalmente idearon el presente hallazgo, un compuesto para reducir los lípidos en sangre y elevar las lipoproteínas de alta densidad, y un método

para fabricarlo.

El mayor objetivo era encontrar el método para fabricar el compuesto que redujera los lípidos en sangre y elevara las lipoproteínas de alta densidad de acuerdo con el punto 1, que incluye monascina y puede conseguir los efectos deseados de forma efectiva.

De acuerdo con dicho objetivo, basamos la composición en la monascina, que es un pigmento amarillo del Monascus y se extrae del producto fermentado con dicho moho. Del proceso de extracción se obtiene un compuesto que contiene monascina que puede reducir la concentración de los lípidos en sangre a la vez que eleva la concentración de las lipoproteínas de alta densidad de forma efectiva.

Dicho proceso de extracción comprende los siguientes pasos: (1) obtener un producto fermentado con

Monascus; (2) tratar el producto fermentado con Monascus con acetona tres veces; (3) elevar la concentración del

producto obtenido en el paso previo por descompresión en un rango específico de temperatura; (4) separar la fracción de pigmentos por cromatografía en columna de gel de sílice; (5) separar la fracción del pigmento amarillo de la fracción de pigmentos por cromatografía en columna Sephadex LH-20; (6) separar la fracción conteniendo monascina y ankaflavina de la fracción del pigmento amarillo por cromatografía en columna de gel de sílice; y (7) separar la monascina de la fracción que contiene monascina y ankaflavina obtenida en el paso previo por un preparado por cromatografía líquida de alta eficacia (pre-HPLC).

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método de fabricación de un compuesto que disminuya los lípidos en sangre y eleve las lipoproteínas de alta densidad de acuerdo con la reivindicación 3, compuesto que incluiría ankaflavina, un pigmento amarillo del Monascus que es extraído de productos fermentados con dicho moho.

De acuerdo con dicho objetivo, proporcionamos un método para, a través de una serie de procesos de extracción, obtener un compuesto que contenga ankaflavina, que puede reducir la concentración de lípidos y elevar la concentración de lipoproteínas de alta densidad en sangre de forma efectiva.

Dicho proceso de extracción comprende los siguientes pasos: (1) obtener un producto fermentado con

Monascus-, (2) tratar el producto fermentado con Monascus con acetona tres veces; (3) elevar la concentración del

producto obtenido en el paso anterior por descompresión en un rango específico de temperatura; (4) separar la fracción de pigmentos por cromatografía en columna de gel de sílice; (5) separar la fracción del pigmento amarillo de la fracción de pigmentos por cromatografía en columna Sephadex LH-20; (6) separar la fracción que contiene monascina y ankaflavina de la fracción del pigmento amarillo por cromatografía en columna de gel de sílice; y (7) separar la ankaflavina de la fracción que contiene monascina y ankaflavina obtenida en el paso previo por pre- HPLC.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método de fabricación de un compuesto que disminuya los lípidos en sangre y eleve las lipoproteínas de alta densidad de acuerdo con el punto 5, compuesto que incluiría monascina y ankaflavina, ambos pigmentos amarillos extraídos de productos fermentados con Monascus.

De acuerdo con dicho objetivo, proporcionamos un método para, a través de una serie de procesos de extracción, obtener un compuesto que contenga monascina y ankaflavina, cuya composición puede reducir la concentración de lípidos y elevar la concentración... [Seguir leyendo]

1. Método de elaboración de un compuesto para reducir los lipidos en sangre y elevar la concentración de

llpoprotelna de alta densidad. Este método consta de los siguientes pasos:

(1) Obtener un producto fermentado con Monascus\

(2) tratar el producto fermentado con Monascus tres veces con acetona, estando la relación producto fermentado : acetona en el rango 1:10 ~ 1:50;

(3) elevar la concentración del producto obtenido en el paso previo por un proceso de descompresión en un rango de temperatura entre 40°C ~60°C;

(4.1) añadir el producto obtenido en el paso (3) a una columna de gel de sílice;

(4.2) añadir una serie de soluciones de lavado a la columna de gel de sílice de forma secuencial, de acuerdo con el paso (4.2), hexano, hexano : etanol = 9:1, hexano : etanol = 8:2, hexano : etanol = 7:3, hexano : etanol = 1:1, y etanol;

(4.3) recoger 12~15 fracciones de las que fluyen desde la columna de gel de sílice;

(4.4) analizar las fracciones recogidas en el paso previo con cromatografía líquida de alta eficacia junto con una matriz de fotodlodos (HPLC-PDA), y conservar las fracciones que contengan monasclna y ankaflavlna;

(4.5) mezclar las fracciones conseguidas en el paso previo para formar una fracción de pigmento;

(5) separar la fracción de pigmento amarillo de la fracción de pigmento con una cromatografía en columna Sephadex LH-20;

(6.1) añadir la fracción de pigmento obtenida en el paso (5) a una columna de gel de sílice;

(6.2) añadir una serie de soluciones de lavado a la columna de gel de sílice de forma secuencial, de acuerdo con el paso (6.2), diclorometano : etanol = 95:5, diclorometano : etanol = 9:1, and dlclorometano : etanol = 4:1;

(6.3) recoger 3~5 fracciones de las que fluyen desde la columna de gel de sílice;

(6.4) analizar las fracciones recogidas en el paso previo por HPLC-PDA, y recoger las fracciones que contengan monascina y ankaflavina;

(6.5) mezclar las fracciones recogidas en el paso previo para formar una fracción específica que contenga monascina y ankaflavina;

(7.1) lavar y separar la fracción específica que contiene monasclna y ankaflavina obtenida en el paso (6) por columna C-i8 en combinación con cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) y una solución de lavado metanol:agua = 85:15;

(7.2) recoger dos fracciones de las que fluyen de la columna Ci8; y

(7.3) analizar las fracciones recogidas en el paso previo con HPLC-PDA, y recoger las fracciones que contengan monascina.

2. En el método de elaboración de un compuesto para reducir los lipidos en sangre y elevar la concentración de

lipoproteína de alta densidad de acuerdo al punto 1, el paso 5 se subdivide en los siguientes pasos:

(5.1) añadir la fracción obtenida en el paso (4) a una columna Sephadex LH-20;

(5.2) añadir una solución de lavado metanol: acetonitrilo = 9:1 a la columna Sephadex LH-20;

(5.3) recoger 3~5 fracciones de las que fluyen desde la columna Sephadex LH-20;

(5.4) analizar las fracciones obtenidas en el paso previo por HPLC-PDA, y recoger las fracciones que contengan monascina y ankaflavina; y

(5.5) mezclar las fracciones recogidas en el paso previo para formar la fracción de pigmento amarillo;

3. Método de elaboración de un compuesto para reducir los lípidos en sangre y elevar la concentración de

lipoproteína de alta densidad. Este método consta de los siguientes pasos:

(1) Obtener un producto fermentado con Monascus\

(2) tratar el producto fermentado con Monascus tres veces con acetona, estando la relación producto fermentado : acetona en el rango 1:10 ~ 1:50;

(3) elevar la concentración del producto obtenido en el paso previo por un proceso de descompresión en un rango de temperatura entre 40°C ~60°C;

(4.1) añadir el producto obtenido en el paso (3) a una columna de gel de sílice;

(4.2) añadir una serie de soluciones de lavado a la columna de gel de sílice de forma secuencial, de acuerdo con el paso (4.2), hexano, hexano : etanol = 9:1, hexano : etanol = 8:2, hexano : etanol = 7:3, hexano : etanol = 1:1, y etanol;

(4.3) recoger 12-15 fracciones de las que fluyen desde la columna de gel de sílice;

(4.4) analizar las fracciones recogidas en el paso previo con cromatografía líquida de alta eficacia junto con una matriz de fotodiodos (HPLC-PDA), y conservar las fracciones que contengan monascina y ankaflavina; y

(4.5) mezclar las fracciones conseguidas en el paso previo para formar una fracción de pigmento;

(5) separar la fracción de pigmento amarillo de la fracción de pigmento con una cromatografía en columna Sephadex LH-20;

(6.1) añadir la fracción de pigmento obtenida en el paso (5) a una columna de gel de sílice;

(6.2) añadir una serie de soluciones de lavado a la columna de gel de sílice de forma secuencial, de acuerdo con el paso (6.2), diclorometano : etanol = 95:5, diclorometano : etanol = 9:1, and diclorometano : etanol = 4:1;

(6.3) recoger 3-5 fracciones de las que fluyen desde la columna de gel de sílice;

(6.4) analizar las fracciones recogidas en el paso previo por HPLC-PDA, y recoger las fracciones que contengan monascina y ankaflavina;

(6.5) mezclar las fracciones recogidas en el paso previo para formar una fracción específica que contenga monascina y ankaflavina;

(7.1) lavar y separar la fracción específica que contiene monascina y ankaflavina obtenida en el paso (6) por columna C-is en combinación con cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) y una solución de lavado metanol:agua = 85:15;

(7.2) recoger dos fracciones de las que fluyen de la columna C-is; y

(7.3) analizar las fracciones recogidas en el paso previo con HPLC-PDA, y recoger las fracciones que contengan ankaflavina.

4. En el método de elaboración de un compuesto para reducir los lípidos en sangre y elevar la concentración de

lipoproteína de alta densidad de acuerdo al punto 3, el paso 5 se subdivide en los siguientes pasos:

(5.1) añadir la fracción obtenida en el paso (4) a una columna Sephadex LH-20;

(5.2) añadir una solución de lavado metanol : acetonitrilo = 9:1 a la columna Sephadex LH-20;

(5.3) recoger 3-5 fracciones de las que fluyen desde la columna Sephadex LH-20;

(5.4) analizar las fracciones obtenidas en el paso previo por HPLC-PDA, y recoger las fracciones que contengan monascina y ankaflavina; y

(5.5) mezclar las fracciones recogidas en el paso previo para formar la fracción de pigmento amarillo;

5. Método de elaboración de un compuesto para reducir los lipidos en sangre y elevar la concentración de lipoproteína de alta densidad. Este método consta de los siguientes pasos:

(1) Obtener un producto fermentado con Monascus',

(2) tratar el producto fermentado con Monascus tres veces con acetona, estando la relación producto fermentado : acetona en el rango 1:10 ~ 1:50;

(3) elevar la concentración del producto obtenido en el paso previo por un proceso de descompresión en un rango de temperatura entre 40°C ~60°C;

(4.1) añadir el producto obtenido en el paso (3) a una columna de gel de sílice;

(4.2) añadir una serie de soluciones de lavado a la columna de gel de sílice de forma secuencial, de acuerdo con el paso (4.2), hexano, hexano : etanol = 9:1, hexano : etanol = 8:2, hexano : etanol = 7:3, hexano : etanol = 1:1, y etanol;

(4.3) recoger 12~15 fracciones de las que fluyen desde la columna de gel de sílice;

(4.4) analizar las fracciones recogidas en el paso previo con cromatografía líquida de alta eficacia junto con una matriz de fotodlodos (HPLC-PDA), y conservar las fracciones que contengan monasclna y ankaflavlna; y

(4.5) mezclar las fracciones conseguidas en el paso previo para formar una fracción de pigmento;

(5) separar la fracción de pigmento amarillo de la fracción de pigmento con una cromatografía en columna Sephadex LH-20;

(6.1) añadir la fracción de pigmento obtenida en el paso (5) a una columna de gel de sílice;

(6.2) añadir una serie de soluciones de lavado a la columna de gel de sílice de forma secuencial, de acuerdo con el paso (6.2), diclorometano : etanol = 95:5, diclorometano : etanol = 9:1, and dlclorometano : etanol = 4:1;

(6.3) recoger 3~5 fracciones de las que fluyen desde la columna de gel de sílice;

(6.4) analizar las fracciones recogidas en el paso previo por HPLC-PDA, y recoger las fracciones que contengan monascina y ankaflavina;

(6.5) mezclar las fracciones recogidas en el paso previo para formar una fracción específica que contenga monasclna y ankaflavina;

(7.1) lavar y separar la fracción específica que contiene monascina y ankaflavina obtenida en el paso (6) por columna C-is en combinación con cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) y una solución de lavado metanol:agua = 85:15;

(7.2) recoger dos fracciones de las que fluyen de la columna C-|8; y

(7.3) analizar las fracciones recogidas en el paso previo con HPLC-PDA, y recoger las fracciones que contengan ankaflavlna.

(8) mezclar la monascina y la ankaflavina de acuerdo a una proporción específica entre 1:1 y 10:1, siendo el valor óptimo de la proporción 3.56:1.

6. En el método de elaboración de un compuesto para reducir los lipidos en sangre y elevar la concentración de lipoproteína de alta densidad de acuerdo al punto 5, la composición contiene monascina y ankaflavina, ambos pigmentos amarillos del Monascus extraídos de un producto fermentado de Monascus, en el que la proporción de contenido de la monascina en relación a la ankaflavina es de 1:1 a 10:1.

7. En el método de elaboración de un compuesto para reducir los lipidos en sangre y elevar la concentración de lipoproteína de alta densidad de acuerdo al punto 6, la proporción óptima entre el contenido de monascina y ankaflavina es 3.56:1.

8. En el método de elaboración de un compuesto para reducir los lipidos en sangre y elevar la concentración de lipoproteína de alta densidad de acuerdo al punto 5, el paso (5) se subdivide a su vez en los siguientes pasos:

(5.2) añadir una solución de lavado metanol: acetonitrilo = 9:1 a la columna Sephadex LH-20;

(5.3) recoger 3~5 fracciones de las que fluyen desde la columna Sephadex LH-20;

(5.4) analizar las fracciones obtenidas en el paso previo por HPLC-PDA, y recoger las fracciones que contengan monascina y ankaflavina; y

(5.5) mezclar las fracciones recogidas en el paso previo para formar la fracción de pigmento amarillo;

Donde la solución de lavado en el paso (5.2) es Metanol:Acetonitrilo=9:1.