Método para determinar si una célula tumoral presenta potencial invasivo y/o metastásico, y agentes moduladores de la transformación maligna.

Un método para identificar un agente modulador de la transformación maligna de células mediada por la glicofosfoproteína osteopontina (OPN),

en donde hay una fijación y una migración potenciadas de células malignas y una contribución potenciada al crecimiento de células tumorales independiente del anclaje, método que comprende las operaciones de:

- proporcionar un ensayo que comprende al menos un miembro seleccionado del grupo que comprende RAN, la Proteína 1 Ligante de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento activo de RAN y una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento activo de la Proteína 1 Ligante de RAN,

- poner un candidato a agente modulador en contacto con dicho ensayo bajo unas condiciones adecuadas; y

- detectar una variación en la actividad del ensayo al comparar la actividad del ensayo sin dicho candidato con la actividad del ensayo en presencia de dicho candidato.

Método para determinar si una célula tumoral presenta potencial invasivo y/o metastásico, y agentes moduladores de la transformación maligna Campo de la invención Un ensayo para identificar un agente modulador de la transformación maligna de células mediada por OPN y/o la vía de señalización de OPN.

Antecedentes de la invención La metástasis es la causa principal del fallo del tratamiento en diversos tipos de cáncer y, particularmente, en pacientes con cáncer de mama. La glicofosfoproteína osteopontina (OPN) de la matriz extracelular es normalmente 10 secretada por osteoblastos y es utilizada como una molécula de adhesión extracelular. La osteopontina ha sido también asociada con ciertos aspectos de la transformación maligna (1) al potenciar la fijación y migración de células malignas y contribuir al crecimiento de células tumorales independiente del anclaje (2, 3) . Se ha determinado que la transfección de células mamarias benignas y no metastásicas de rata con cDNA para OPN dota a los transfectantes de la capacidad para sobreproducir OPN in vitro y producir metástasis in vivo (4) . Se ha asociado la sobreexpresión de OPN con un mal pronóstico en el cáncer primario humano de mama (5, 6) y se ha mostrado que la OPN es el factor individual de pronóstico más potente en un análisis multivariante frente a los resultados, en un futuro gran estudio sobre pacientes con cáncer de mama (7) . Aunque se sabe que los niveles plasmáticos de OPN en circulación son mayores en los pacientes con cáncer metastásico de mama (8) , sigue sin estar claro el mecanismo molecular exacto de la metástasis regulada por OPN.

Sumario de la invención La RAN GTPasa (RAN) es una pequeña proteína ligante de GTP (guanosina trifosfato) de la superfamilia RAS. Se ha determinado que RAN es esencial para la translocación de RNA y proteínas a través del complejo del poro nuclear. Se ha comunicado que una asociación directa entre RAN y oncoproteínas víricas, tales como E1A de adenovirus humano, E7 de papilomavirus humano y antígeno T grande de SV40, está estrechamente asociada con 25 la transformación celular y la inestabilidad genómica inducidas por una infección vírica (27) , y se ha determinado que la RAN GTPasa está muy expresada en la mayor parte de las examinadas líneas celulares de adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas procedentes de diversos órganos, incluyendo el estómago, los pulmones, la cabeza y el cuello, el páncreas y el colon, y también en células tumorales metastásicas (29) , pero no en las células normales de esos tejidos tumorales (28) . Se ha determinado también que la RAN regula la síntesis de DNA y la progresión del ciclo celular del huso (26) .

Aunque se ha determinado que la RAN está asociada con un crecimiento celular incontrolado, la determinación del crecimiento celular no da una medida del proceso de metástasis, que es un proceso en gran medida independiente.

Al analizar la expresión génica entre la línea Rama 37 (R37) de células mamarias benignas de rata y las células R37 establemente transfectadas con un vector de expresión para OPN, denominadas células R37-OPN, en donde las células primeras producen bajos niveles de OPN y son no invasivas y no metastásicas (9) mientras que las células segundas producen niveles elevados de OPN y son invasivas, los inventores han determinado que la RAN desempeña un papel adicional en la invasión y la metástasis y que la RAN y la Proteína 1 Ligante de RAN (RANBP1; del inglés RAN Binding Protein 1) presentan una expresión sustancialmente aumentada en asociación con la OPN.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para determinar si una célula tumoral presenta potencial invasivo/metastásico, que comprende las operaciones:

determinar el nivel de un marcador en una célula tumoral de una muestra, en donde el marcador es al menos un miembro seleccionado del grupo que comprende RAN, la Proteína 1 Ligante de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido 45 nucleico que codifica RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento activo de RAN y una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento activo de la Proteína 1 Ligante de RAN, y

comparar el nivel del marcador detectado en dicha célula tumoral con el nivel determinado para el marcador en una célula tumoral no invasiva y/o no metastásica,

en donde un aumento del nivel del marcador en la célula tumoral de la muestra es indicativo de que la célula tumoral presenta potencial invasivo y/o metastásico.

Adecuadamente, la muestra puede ser un tejido o células de un sujeto. En realizaciones, se puede aislar la muestra del sujeto, se puede aislar la célula tumoral de la muestra y/o se puede aislar el contenido de la célula, por ejemplo, mRNA o proteínas, antes de que se determine el nivel del marcador. En realizaciones, el nivel del marcador en una célula tumoral invasiva y/o metastásica es al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, el nivel del marcador en una célula no invasiva y/o metastásica.

Por potencial invasivo y/o metastásico se quiere significar que la célula tumoral es invasiva y/o metastásica o está progresando hacia ser invasiva y/o metastásica.

Como se apreciará, este método puede ser empleado para determinar si un sujeto está aquejado de un tumor invasivo/metastásico.

También se describe un método para evaluar si un sujeto está aquejado de un tumor invasivo/metastásico, que comprende las operaciones:

determinar el nivel de un marcador en una célula tumoral de una muestra de un sujeto, en donde el marcador es al

menos un miembro seleccionado del grupo que comprende RAN, la Proteína 1 Ligante de RAN y un derivado de las mismas, y

comparar el nivel del marcador detectado en dicha célula tumoral con el nivel determinado para el marcador en una célula tumoral no invasiva y/o no metastásica,

en donde un aumento del nivel del marcador en la célula tumoral de la muestra es indicativo de que el sujeto está 15 aquejado de un tumor que presenta potencial invasivo/metastásico.

Además de permitir la medición del potencial invasivo y/o metastásico de una célula tumoral en un único punto temporal, se proporciona la medición del potencial invasivo y/o metastásico de una (s) célula (s) tumoral (es) en múltiples puntos temporales.

En consecuencia, un segundo aspecto de la presente invención proporciona un método in vitro para controlar una célula tumoral con objeto de determinar el potencial invasivo y/o metastásico de dicha célula tumoral, método que comprende las operaciones de:

a) detectar el nivel de un marcador en la célula tumoral en un primer punto temporal, en donde el marcador es al menos un miembro seleccionado del grupo que comprende RAN, la Proteína 1 Ligante de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento activo de RAN y una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento activo de la Proteína 1 Ligante de RAN,

b) repetir la operación a) en un punto temporal posterior, y

c) comparar los niveles del marcador en las operaciones a) y b) , en donde un aumento del nivel del marcador desde un primer punto temporal hasta un posterior punto temporal es indicativo de que la célula tumoral está adquiriendo potencial invasivo y/o metastásico.

En el periodo entre el primer punto temporal y un punto temporal posterior, se puede aplicar un agente de ensayo a la célula tumoral para determinar si el nivel del marcador se ve afectado por dicho agente de ensayo. En realizaciones particulares, la célula tumoral puede ser sometida a una condición particular, tal como, por ejemplo,

radiación, cirugía o similar, en el periodo entre la detección del nivel del marcador en el primer punto temporal y la detección en un punto temporal posterior.

También se describe un método para controlar la progresión de un cáncer en un sujeto, que comprende las operaciones de:

a) detectar, en un primer punto temporal, el nivel de un marcador en una muestra de un tumor de un sujeto, en donde el marcador es al menos un miembro seleccionado del grupo que comprende RAN, la Proteína 1 Ligante de RAN, un fragmento activo de un polipéptido... [Seguir leyendo]

1. Un método para identificar un agente modulador de la transformación maligna de células mediada por la glicofosfoproteína osteopontina (OPN) , en donde hay una fijación y una migración potenciadas de células malignas y una contribución potenciada al crecimiento de células tumorales independiente del anclaje, método que comprende las operaciones de:

-proporcionar un ensayo que comprende al menos un miembro seleccionado del grupo que comprende RAN, la Proteína 1 Ligante de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento activo de

RAN y una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento activo de la Proteína 1 Ligante de RAN,

-poner un candidato a agente modulador en contacto con dicho ensayo bajo unas condiciones adecuadas; y

-detectar una variación en la actividad del ensayo al comparar la actividad del ensayo sin dicho candidato con la actividad del ensayo en presencia de dicho candidato.

2. Un método para determinar si una célula tumoral presenta potencial invasivo y/o metastásico, que comprende 15 las operaciones:

determinar el nivel de un marcador en una célula tumoral de una muestra, en donde el marcador es al menos un miembro del grupo que comprende RAN, la Proteína 1 Ligante de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento activo de RAN y una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento activo de la Proteína 1 Ligante de RAN, y

comparar el nivel del marcador detectado con el nivel determinado para el marcador en una célula tumoral no invasiva y/o no metastásica,

en donde un aumento del nivel del marcador en la célula tumoral de la muestra es indicativo de que la célula tumoral 25 presenta potencial invasivo y/o metastásico.

3. Un método in vitro para controlar un tumor con objeto de determinar el potencial invasivo y/o metastásico de dicho tumor, método que comprende las operaciones de:

a) detectar el nivel de un marcador en la célula tumoral en un primer punto temporal, en donde el marcador es al menos un miembro del grupo que comprende RAN, la Proteína 1 Ligante de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento activo de RAN y una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento activo de la Proteína 1 Ligante de RAN,

b) repetir la operación a) en un punto temporal posterior, y

c) comparar los niveles del marcador en las operaciones a) y b) , en donde un aumento del nivel del marcador desde un primer punto temporal hasta un posterior punto temporal es indicativo de que la célula tumoral está adquiriendo potencial invasivo y/o metastásico.

4. Un método para la identificación de un agente que inhibe la invasión y/o la metástasis por una célula tumoral en una muestra, método que comprende las operaciones:

obtener de una muestra al menos unas partes alícuotas primera y segunda, en donde cada parte alícuota comprende al menos una célula tumoral;

exponer una primera parte alícuota de la muestra a un primer agente de ensayo;

exponer una segunda parte alícuota de la muestra a un segundo agente de ensayo;

opcionalmente, exponer otra parte alícuota de la muestra a otro respectivo agente de ensayo;

determinar el nivel de un marcador de una célula tumoral de cada parte alícuota, en donde el marcador es al menos un miembro del grupo que comprende RAN, la Proteína 1 Ligante de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento activo de RAN y una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento 50 activo de la Proteína 1 Ligante de RAN, comparar los niveles del marcador detectados en cada una de las partes alícuotas, e identificar el agente que proporciona un nivel más bajo de marcador en una parte alícuota con ese agente con respecto a los demás agentes.

5. Un método para la identificación de un agente que puede causar invasión y/o metástasis por una célula 5 tumoral, método que comprende las operaciones:

obtener de la muestra al menos unas partes alícuotas primera y segunda, en donde cada parte alícuota comprende al menos una célula tumoral;

exponer una primera parte alícuota de la muestra a un primer agente de ensayo;

determinar el nivel de un marcador de una célula tumoral de cada parte alícuota, en donde el marcador es al menos un miembro del grupo que comprende RAN, la Proteína 1 Ligante de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento activo de RAN y una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento activo de la Proteína 1 Ligante de RAN, y

comparar los niveles del marcador detectados en cada una de las partes alícuotas,

en donde un nivel aumentado del marcador en la parte alícuota expuesta al agente, con respecto a la parte alícuota no expuesta al agente, es indicativo de que el agente presenta potencial invasivo y metastásico.

6. Los métodos según cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 5, en donde el nivel del marcador se determina detectando un polinucleótido transcrito, o una porción del mismo, que codifica RAN o la Proteína 1 Ligante de RAN.

7. El método según cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 5, en donde el nivel del marcador se determina detectando la unión de un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo con especificidad de unión hacia un polipéptido de RAN, un polipéptido de la Proteína 1 Ligante de RAN, un fragmento activo de RAN o un fragmento activo de la Proteína 1 Ligante de RAN.

8. Uso de un kit que comprende un reactivo seleccionado de entre:

a) un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo con especificidad de unión hacia RAN, la Proteína 1 Ligante de RAN, un fragmento activo de RAN o un fragmento activo de la Proteína 1 Ligante de RAN, o b) una sonda de ácido nucleico capaz de hibridarse con un ácido nucleico que codifica RAN, la Proteína 1 Ligante de RAN o un fragmento activo de RAN o un fragmento activo de la Proteína 1 Ligante de RAN,

en el diagnóstico in vitro de si una célula tumoral es invasiva o metastásica, en donde se evalúa el nivel de al menos un miembro del grupo que comprende RAN, la Proteína 1 Ligante de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de RAN, un fragmento activo de un polipéptido de la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica la Proteína 1 Ligante de RAN, una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento activo de RAN, y una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento activo de la Proteína 1 Ligante de RAN.

9. Un ácido nucleico que es capaz de unirse, bajo condiciones rigurosas, con un polinucleótido que codifica RAN (ID. SEC. nº 1) o con un polinucleótido que codifica la Proteína 1 Ligante de RAN (ID. SEC. nº 3) o un fragmento de dicho polinucleótido que codifica un fragmento activo de RAN o codifica un fragmento activo de la Proteína 1 Ligante de RAN, para uso en el tratamiento de un cáncer metastásico y/o invasivo.

10. Un ácido nucleico para uso en el tratamiento de un cáncer metastásico y/o invasivo según la Reivindicación 9,

en donde dicho ácido nucleico es seleccionado de entre la ID. SEC. nº 5, la ID. SEC. nº 6, la ID. SEC. nº 7, la ID. SEC. nº 8, la ID. SEC. nº 9 y la ID. SEC. nº 10.

11. Un ácido nucleico para uso en el tratamiento de un cáncer metastásico y/o invasivo según la Reivindicación 9 o la Reivindicación 10, caracterizado por que dicho cáncer es cáncer de mama.

12. Un kit que comprende un reactivo seleccionado de entre:

a) un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo con especificidad de unión hacia RAN, la Proteína 1 Ligante de RAN, o un fragmento activo de RAN o un fragmento activo de la Proteína 1 Ligante de RAN, o b) una sonda de ácido nucleico capaz de hibridarse con un ácido nucleico que codifica RAN, la Proteína 1 Ligante de RAN o un fragmento activo de RAN o de la Proteína 1 Ligante de RAN,

para uso en un método para el diagnóstico in vivo de si una célula tumoral es invasiva o metastásica.